BRAFV600E基因突變與甲狀腺微小乳頭狀癌中央區淋巴結轉移相關性研究

謝伯劍 鄭海紅 甘梅富

甲狀腺癌是內分泌系統最常見的惡性腫瘤[1]，過去幾十年中全世界甲狀腺癌的發病率急劇增加[2-3]，特別是在我國臺州等沿海城市，每年有很多新發病例。這些新發病例大多數是甲狀腺微小乳頭狀癌（papillary thyroid microcarcinoma，PTMC）[4-5]，即直徑≤10mm 的甲狀腺乳頭狀癌[6]。盡管PTMC的生物學行為往往趨向良性，患者病死率較低，但臨床實踐證明，仍有部分的PTMC會復發、轉移甚至影響患者的生命[7]。V-RAF小鼠肉瘤病毒癌基因同源物B1（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）基因突變是甲狀腺乳頭癌常見的基因變異形式，發生率可高達29%～88%[8-9]。研究證實，BRAFV600E的突變與PTMC的侵襲性有關，如甲狀腺腺體外侵犯、淋巴結轉移、腫瘤復發等[7,10-12]。本文就BRAFV600E基因突變和PTMC中央區淋巴結轉移的相關性進行回顧性研究，探討BRAFV600E基因突變是否能作為PTMC中央區淋巴結轉移的危險預測因素[13]，為PTMC的精準外科干預提供理論依據。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2014年10月至2016年3月于我院行手術切除的PTMC患者的石蠟包埋標本200例用于本研究。所有患者均符合以下要求：（1）術前均通過超聲診斷為單側腫瘤；（2）術中和術后經病理學檢查明確診斷為PTMC；（3）行單側腺葉+峽部切除術和同側中央區淋巴結清掃術；（4）常規檢測腫瘤組織BRAFV600E基因突變情況。

1.2 Real-time PCR檢測BRAFV600E突變 收集符合標準的石蠟標本，選擇蠟塊中間部分，行10μm切片，由病理科醫師確認含腫瘤組織。以礦物油去除石蠟，離心裂解組織樣本，向離心管水相中加入20μl蛋白酶K消化組織蛋白，孵育后向離心管加入RNase A去除RNA，使用 DNA提取試劑盒（Aide Biotechnology產品，批號：H215091801Y）提取DNA并進行測序。采用人BRAFV600E突變檢測試劑盒（Aide Biotechnology產品，批號：P215101901X）檢測BRAFV600E突變，嚴格按照使用說明書操作。陰性對照、陽性對照、內部質量控制等均按試劑盒說明書進行。待反應結束分析收集到的熒光信號，在陰性、陽性對照、內部質量控制均在合適范圍的前提下，若待測基因循環閾值（Ct）＜28為BRAFV600E突變陽性，Ct≥28則為突變陰性。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用t檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；相關性分析采用單因素和多因素logistic回歸分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PTMC患者的臨床病理資料 本研究共納入患者男 38 例，女 162 例，年齡 21～70（44.5±10.0）歲；腫瘤直徑 1～10（6.3±2.0）mm。患者的臨床病理特征見表 1。

表1 PTMC患者的臨床病理特征

2.2 BRAFV600E突變與臨床病理特征的關系 BRAFV600E突變與PTMC患者臨床病理特征的關系見表2。單因素和多因素分析顯示，BRAFV600E突變與中央區淋巴結轉移存在相關性（P＜0.05）。

表2 BRAFV600E突變與臨床病理特征的關系

2.3 BRAF突變與中央區淋巴結轉移的關系BRAFV600E突變陽性者存在中央區淋巴結轉移的比例高于突變陰性者，差異有統計學意義（P＜0.05），而BRAFV600E突變陽性者中央區淋巴結切除數量以及轉移數量與突變陰性者比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表 3。

2.4 PTMC患者BRAFV600E突變相關因素的分層分析 為進一步了解BRAFV600E突變與中央區淋巴結轉移的統計學關聯，將患者按照腫瘤大小進行分組，在腫瘤大小不同的組內進行logistic回歸分析，以探討不同大小腫瘤中BRAFV600E突變和中央區淋巴結轉移是否存在統計學關聯。以腫瘤大小為分層標準進行單因素分析，結果見表4。進一步多因素分析顯示，腫瘤大小≤5mm的患者中，合并橋本病與BRAFV600E突變相關（OR=2.362，95%CI:1.006～5.705，P=0.036）。腫瘤大小＞5mm 的患者中，中央區淋巴結轉移與BRAFV600E突變相關（OR=0.817，95%CI:0.451～0.907，P=0.037）。

表3 BRAF突變與中央區淋巴結轉移的關系

3 討論

BRAF是一個原癌基因，位于7號染色體，能夠編碼一種絲氨酸/蘇氨酸特異性激酶，BRAFV600E異常激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路，是該信號通路中最為關鍵的激活因子。BRAF基因點突變的位置在CR3區15號外顯子的1799位點。該位點發生T-A變化，導致密碼子600位的纈氨酸（V）被谷氨酸（E）取代，即V600E突變。這一突變使維持BRAF基因失活的P環失效，導致BRAF基因活化[14]。激活的BRAF繼續在MAPK信號轉導通路發生影響，發生級聯式激活反應，引起細胞的異常增殖和分化，最終導致腫瘤的形成。大量研究已經表明，BRAFV600E是PTC中最常見的遺傳事件，發生率29%～88%[8-9]，揭示BRAF基因可能與甲狀腺癌的分化增殖密切相關。本研究發現，PTMC患者中BRAFV600E的突變率為84.5%。同時有研究表明，在甲狀腺良性病變中不存在BRAFV600E突變[15]，說明BRAFV600E突變可以作為預測甲狀腺癌的分子指標，即如果術前發現有BRAFV600E突變，提示腫瘤為惡性的可能性大，需要行外科手術干預。

本研究進一步分析了BRAFV600E同中央區淋巴結轉移的關系，發現中央區淋巴結轉移與BRAFV600E突變之間存在相關性，BRAFV600E突變陽性者發生中央區淋巴結轉移的比例高于突變陰性者，但是BRAFV600E突變陽性者中央區淋巴結清掃數量及轉移數量與突變陰性者并無統計學差異。理論上腫瘤BRAF突變陽性，侵襲性增強，向中央區淋巴結轉移的概率增大，轉移淋巴結的數量也應增加，但本文并未得到這樣的結果。筆者認為可能的原因有以下兩方面：一方面本研究選擇患者術后的標本進行BRAF突變檢測，因此BRAF是否突變不會影響術中的清掃決策；另一方面可能與本研究樣本量偏小有關。但BRAFV600E突變陽性者發生中央區淋巴結轉移的比例更高，由此筆者認為BRAFV600E突變對中央區淋巴結轉移具有一定預測價值，因此推斷BRAFV600E基因突變狀態可作為術前預測淋巴結轉移的危險因素，該結果與 Sun等[9]和 Shi等[16]的研究一致。Fraser等[17]發現PTC中的BRAFV600E突變預示著淋巴結轉移、甲狀腺包膜外累及和無病生存率降低的風險增加。Zheng等[18]發現，BRAFV600E突變與臨床病理結果不良密切相關，可能導致PTMC復發增加。即使是臨床淋巴結陰性的PTC患者，包括PTMC患者，中央區淋巴結也容易發生隱匿性轉移；而且隨著腫瘤體積的增大，中央區淋巴結發生轉移的概率也明顯增加。本研究還發現BRAFV600E突變陽性且直徑＞5mm的PTMC更易發生中央區淋巴結轉移，預示該類型的腫瘤侵襲性更強，該結果與Wang等[19]及Vorasubin等[20]發表的研究結果一致，提示對于懷疑甲狀腺癌的患者可以進行術前細針穿刺活檢，并對活檢組織進行BRAFV600E突變檢測，有利于更加精確地判斷腫瘤的良惡性。腫瘤直徑＞5mm且BRAFV600E突變陽性的PTMC患者，出現轉移和復發的概率更大，這可能與腫瘤體積增大，侵襲能力增加有關。腫瘤直徑＞5mm且BRAFV600E突變陽性是相對高危的PTMC類型，需要進行更積極的外科手術干預[21-22]。手術時在有效保護喉返神經和甲狀旁腺的情況下，應常規進行患側中央區淋巴結清掃術，有利于進一步明確腫瘤分期，為PTMC的個體化治療提供理論依據。對于腫瘤直徑≤5mm的患者，本研究發現BRAFV600E突變狀態與淋巴結轉移無相關性，這可能是由于研究樣本數量有限有關，最終結論可尚待擴大樣本量后進一步驗證。

表4 BRAFV600E突變以腫瘤大小不同分層的單因素分析

綜上所述，本研究證實BRAFV600E突變、腫瘤大小有助于預測PTMC患者的中央區淋巴結轉移情況。對于BRAFV600E突變陽性且腫瘤直徑＞5mm的PTMC，手術過程中建議常規行中央區淋巴結清掃。本研究還存在以下不足之處：首先，本研究系回顧性分析，偏倚無法避免；其次，本研究所選的患者數量較少，時間跨度較短，缺乏有效的預后數據；最后，本文進行分析的臨床參數項目有限，與中央區淋巴結轉移有關的其他可能因素未被列出。