基于形態學特征和psbA-trnH葉綠體編碼基因序列明確五指山野生茶的分類地位

蘇凡 楊小波 李東海

摘 ?要 ?海南的野生茶樹在植物形態分類學上，在植物分類上一般都認為屬于普洱茶（Camellia sinensis var. assamica），也有人認為是白毛茶（Camellia sinensis var. pubilimba）。五指山市以水滿鄉為代表，是海南野生茶分布的集中地區，為了進一步明確五指山市的野生茶分類地位，本研究通過在五指山市境內8個居群的野生茶植株的觀察和測量。結果表明，五指山市野生茶樹與茶（原變種）、普洱茶和白毛茶（茶的變種）等相比較，在形態方面，五指山市野生茶樹更為接近普洱茶，但也有明顯的區別，五指山市野生茶的葉子要比普洱茶、白毛茶的葉子大，側脈稍多;從花形態分析，普洱茶的花瓣多為6～7枚，白毛茶為5～6枚，五指山市野生茶都是5枚。psbA-trnH葉綠體編碼基因序列測序結果進一步表明，8個居群的五指山市的野茶30個樣品為獨立的一組，與普洱茶、白毛茶并列。我們認為五指山市野生茶也可確定為茶（原變種）的另一個變種，因此，命名為海南五指山水滿茶（Camellia sinensis （Linnaeus） Kuntze var. shuiman F.Su and X.B.Yang），簡稱水滿茶。

關鍵詞 ?形態特征;分子鑒定;psbA-trnH;野生茶;水滿茶;五指山

中圖分類號 ?S571.1 ?????文獻標識碼 ?A

Abstract ?The wild tea in Hainan Island was regarded Camellia sinensis var. assamica （CSA） or C. sinensis var. pubilimba （CSB）. The concentrated distribution?area of the tea is Shuimanxiang， Wuzhishan. In order to further clarify the classification status of the tea， the wild tea plants of eight communities were studied. The morphological characteristics of the tea were closer to CSA than CSB. But there were also obvious differences， since the leaves of the tea was larger than that of CSA and CSB， the side veins of the tea was slightly more than that of CSA and CSB， and the petals of the tea， CSB and CSA was 5， 5-6 and 6-7， correspondingly. The sequence of the psbA-trnH chloroplast coding gene showed that the 30 samples of the eight communities of the tea was an independent group， which is parallel to CSA and CSB. So， the wild tea could also be identified as another variety of C. sinensis. It was named as Camellia sinensis （Linnaeus） Kuntze var. shuiman F. Su and X. B. Yang， short for Shuiman Tea.

Keywords ?morphological characteristics; molecular identification; psbA-trnH; wild tea; Shuiman tea; Wuzhishan

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.08.016

在我國關于茶組植物的分類一直都存在爭議，張宏達[1]在1981年將茶組植物分為17種3變種，1984年訂正后為37個種3個變種[2]，又在1998年修訂為4個變種[3];閔天祿[4]1992年在張氏系統基礎上將茶組植物進行歸并，將茶組植物分為12種6變種;陳亮等[5]2000年全面考察了茶樹種質資源的分子生物學系統， 提出將茶組植物分成5種3變種，將茶組植物分為大廠茶Camellia tachangensis F. S. Zhang、厚軸茶C. crassicolumna Chang、大理茶C. taliensis（W. W. Smith）Melchior、禿房茶C. gymnogyna Chang和茶C. sinensis （L.） O. Kuntze等5個種， 在茶下分茶C. sinensis var. sinensis、普洱茶C. sinensis var. assamica （Masters）Kitamura、白毛茶C. sinensis var. pubilimba Chang等1個原變種，2個變種。海南分布的野生茶有兩個變種，一個為普洱茶變種，俗稱‘海南大葉茶，在五指山市稱‘水滿茶[5-7]，另一個為白毛茶[5]。經過全面調查，發現海南的野生茶在海南分布較廣泛，但最集中的分布區為五指山市及其與瓊中縣的交接區域，以水滿、暢好、沖山和南圣等鄉鎮一些山坡上[8]。目前在海南僅在五指山市形成野生茶栽培與制茶產業，為了明確分布在五指山市境內的野生茶的分類地位，有必要結合形態特征和DNA條形碼技術對該地區的野生茶進行鑒定與分類。

DNA條形碼（DNA barcoding）技術是通過對一個標準目的基因的DNA序列進行分析從而進行物種鑒定的技術[9]。生命條形碼聯盟（CBOL）結合以往研究所提供數據的分析結果，建議將葉綠體基因rbcL、matK、psbA-trnH和核基因ITS作為陸地植物通用的DNA條形碼[10-11]。除了以上這4種DNA條形碼序列，trnL、rpoC1、rpoB、ndhJ等DNA片段也常作為植物的DNA條形碼序列[12]。

DNA條形碼技術已經開始應用于茶屬植物種資資源、親緣關系方面[13-14]。楊俊波等[15]通過線粒體matR基因序列去分析研究了山茶科的分類學范圍和系統演化關系，結果表明山茶亞科和厚皮香亞科不構成姐妹群關系;范文等[16]應用DNA序列分子標記對香港紅山茶（Camellia hongkongensis）個體內多態性研究并對物種進行分子鑒定，確定采集樣本是香港紅山茶;Shih等[17]在2017年利用核糖體內轉錄間隔區序列對臺灣茶葉和進口茶葉的品種鑒定，為臺灣茶葉品種的鑒定分類提供了分子證據。因此，本文在詳細比較分析五指山市的野生茶與茶（原變種）、普洱茶、白毛茶的形態特征基礎上，選取五指山市暢好什沖嶺、南圣毛祥1、南圣毛祥2、番賽村、毛道新泰南嶺、水滿、水滿東松嶺、仕階8個野生茶樹居群，每個居群采10份樣品，共80份樣品，利用葉綠體基因rbcL、matK、psbA-trnH和核基因ITS對五指山市野生茶樹進行PCR擴增后直接測序，將所測的序列在NCBI上進行BLAST找到普洱茶和白毛茶序列并進行對比，明確五指山市野生茶的分類地位。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

五指山野生茶開花季節主要為11月至次年2月[18]，本研究選取野外觀察和測量的時間是2016年10月—2017年8月。通過對基本覆蓋五指山市區野生茶分布區的8個野生茶居群（表1，圖1）的野生茶植株的形態綜合特征進行測量，每個種群觀察的植株為10株，采摘相對標準的成熟葉片，測量葉數量為30片，對野生茶的葉、花、果實進行測量并記錄，采樣10份（表1）。茶（原變種）、普洱茶和白毛茶的形態特征來自《中國植物志》 [3， 19]。

1.2 ?方法

1.2.1 ?試驗設計 ?在上述的每個野生茶樹分布點處，隨機選擇10株野生茶樹個體植株進行采樣，采樣時應該避免采種株間的親緣關系較近，每株之間相距10 m;采集當年生的新鮮幼嫩葉片作為提取基因組DNA的材料，每份樣品采集1份DNA材料，DNA材料應采集3～5 g葉片;8個群落樣方，共80份樣品。將新鮮的植物DNA材料置于柔軟且透氣性較好的紙袋中進行干燥并帶回實驗室，裝在預先準備放有硅膠的信封中，再用封口袋密封，帶回實驗室放在20?℃冰箱中保存。

1.2.2 ?總DNA的提取 ?選擇4個通用引物片段，其中葉綠體基因有3個分別為rbcL、matK、psbA-trnH，核基因有1個為ITS，與野茶樣品反應。PCR擴增反應總體積為25 μL，反應液包含：上下游引物各1 μL，無菌水9.5 μL，mix12.5 μL，DNA樣品1 μL。擴增程序為：94?℃預變性4 min; 94?℃變性30 s，72?℃延伸1 min，35個循環;最后72?℃延伸10?min，rbcL、psbA-trnH、matK和ITS序列的退火溫度分別為54、55、51、50?℃，退火1 min。PCR反應在analytik jena梯度PCR儀上進行。最后把提取出的符合下一步PCR擴增的DNA樣品儲存于4?℃冰箱中保存備用。

1.2.3 ?測序與序列分析 ?PCR擴增的DNA樣品經過測序所獲得的序列采用BioEditver 7.0.9.1軟件[20]編輯并進行人工校對。利用MEGA ver 6.0軟件做NJ進化樹[21]。

2 ?結果與分析

2.1 ?五指山市野生茶樹與普洱茶、白毛茶形態特征比較

五指山市野生茶樹的8個居群植株的形態特征，總體可描述為：高大喬木，小枝幼時有柔毛;葉卵狀橢圓形、長圓狀披針形，倒卵狀橢圓形、倒披針狀橢圓形，葉子常為長13～19?cm、寬5～8?cm，幼葉有不顯著齒或波狀齒，老葉鋸齒深明，常大小相間;側脈11～13對，葉柄5～7 mm，被柔毛。花腋生，白色，花柄長5～7 mm，被柔毛; 苞片2，早落;萼片5，近圓形，長3～5 mm，無毛;花瓣5片，倒卵形，有時為披尖形，長1～2 cm;雄蕊長8～10 mm，離生;子房被茸毛，花柱長7 mm， 先端3裂。蒴果扁三角球形或1個圓球形，直徑約1.5～2 cm，3爿裂開。種子每室1個。總體上，五指山野生茶從形態特征上看，與茶（原變種）和白毛茶差異稍大一些，與普洱茶較為接近，但也有一定的區別：五指山野生茶的葉子要比普洱茶的要大一些，普洱茶的葉子長8～14 cm，寬3.5～7.5 cm，且五指山野生茶的葉子長13～19 cm，寬5～8 cm;五指山野生茶的側脈也比普洱茶多一些，普洱茶的側脈8～9對，而五指山野生茶的側脈11～13對;在花的形態方面，五指山野生茶的花瓣5片，普洱茶的花瓣6～7片，兩者均為蒴果，種子每室1個，但五指山野生茶的蒴果有扁三角球形和圓球形，果爿厚1.5～1.7?mm，普洱茶的蒴果僅描述為扁三角球形，果爿厚1～1.5 mm（表2）。

五指山市8個居群的野生茶樹在形態特征上也有一些差異，主要可分為低海拔組和中高海拔組2組，如圖2A、圖2C、圖2D、圖2F拍攝于暢好什沖嶺海拔（735 m），為低海拔組;圖2B、圖2E、圖2G拍攝于水滿東松嶺海拔（1031 m），為中高海拔組。暢好什沖嶺低海拔組的野生茶葉長圓形或橢圓形，先端鈍或尖銳，鋸齒深明，葉面平，革質化相對明顯;東松嶺高海拔組的野生茶樹葉子偏大長，東松嶺的野茶葉子卵圓形，葉脈突兀，嫩葉先端漸尖。從葉形上看，低海拔組的葉子似乎像茶（原變種）（表2），可能低海拔組的野生茶被栽培茶（原變種）“基因污染”。這有待于進一步研究。

2.2 ?五指山市野生茶樹鑒定與分類分析

2.2.1 ?擴增引物的篩選 ?用4對通用引物進行PCR擴增后，再將擴增產物進行測序，發現只有psbA-trnH引物擴增的產物測序成功，其他3對引物的測序結果不理想，不可用作五指山野生茶種質資源鑒定與分類（表3）。核基因ITS序列在山茶屬中直接測序較為困難，這可能與該屬ITS區序列GC含量較高，種類的雜交和多倍化現象，以及ITS一致性進化是否完全等因素有關，這些因素在一定程度上限制了核基因ITS在山茶屬中的應用[13]。而在葉綠體基因組中，其DNA片段容易擴增和測序，但葉綠體基因組序列相對保守，進化速率較慢，經過篩選，只有psbA-trnH引物葉 葉片下面無毛或初時有柔毛;邊緣有鋸齒。 嫩枝及葉片下面均被有密柔毛;葉邊緣鋸齒不明顯;葉柄無毛。 嫩枝有微毛，頂芽有白柔毛;側脈8～9對，葉邊緣有細鋸齒;葉柄被柔毛。 側脈11～13對，有不顯著齒或波狀齒，老葉鋸齒深明，常大小相間;葉柄被柔毛。

花 花腋生，白色;萼片無毛。 花腋生，白色，花特別小，萼片被灰白色 花腋生，白色，花柄被柔毛;萼片無毛;花瓣6～7片，背面無毛。 花腋生，白色，花柄被柔毛;萼片無毛;花瓣5片，倒卵形，有時為披尖形。

果實 蒴果3球形或1～2球形，每球有種子1～2粒。花期10月至翌年2月。 蒴果3球形或1～2球形，每室有種子1～2粒。 蒴果扁三角球形，3爿裂開，種子每室1個。 蒴果扁三角球形或1個圓球形，3爿裂開，種子每室1個。

2.2.2 ?系統樹的構建和分析 ?80份五指山野生茶材料的PCR成功率為100%;測序所得80份野茶psbA-trnH葉綠體編碼基因序列共30條，成功概率為37.5%;測定的五指山野生茶的psbA-trnH區序列長度為658～687 bp。將所測的的序列在NCBI上進行BLAST找到普洱茶和白毛茶序列并進行對比（圖3）。結果表明，在NJ（neighbor joining）系統發育樹上聚集發現KJ806281（普洱茶）并不是五指山野生茶親緣關系最靠近，卻與KJ806280（白毛茶）親緣關系靠近，所有五指山野生茶的樣品聚集在一起，與白毛茶、普洱茶有一定的分離。此結果表明五指山野生茶與白毛茶和普洱茶都有一定的分離。

3 ?討論

五指山市為海南野生茶樹的主要分布區[8]，且相對集中分布在該市的東南區域，盡管有報道稱海南有白毛茶的分布[5]，但經過詳細的形態特征比較分析和我們的研究結果認為分布在海南五指山市的8個居群的野生茶樹在形態上與白毛茶相差較遠，與普洱茶相似，但也有差別（表2）。結合形態特征與分子技術來明確某一植物居群的分類地位從已經越來越普遍。例如，Liu等[22]2018年通過形態學觀察和測定葉綠體基因的matK、rbcL和trnL-F等3個基因片段并構建系統關系樹，發現了蕨類新物種——印禪雙蓋蕨;陸麗華等[23]結合形態學和分子標記法去鑒定幾種危害嚴重的莧屬入侵植物;Jie等[24]在2018年通過形態學和分子標記法鑒定中國的黃精屬植物，進一步驗證了分子標記結果的準確性和可靠性;溫貝貝[25]運用DNA條形碼檢測技術，選取葉綠體基因組中的序列rbcL、matK、psbA-trnH序列與核基因組中的ITS，ITS2序列作為DNA條形碼候選片段，驗證其對山茶屬植物的應用效力，以期在不受同屬植物外部形態特征相似的情況下對山茶屬植物進行鑒定，分析其親緣關系及物種演化進程。本研究以psbA-trnH基因區間條形碼也成功鑒定五指山野生茶和普洱茶、白毛茶之間的親緣關系，且聚類的結果是，普洱茶與白毛茶較接近，為一組（圖3），所有8個居群的五指山野生茶為另一組。普洱茶和白毛茶均為茶原變種的變種[3]，我們認為五指山野生茶應是茶原變種的另一個變種。在五指山市野生茶這一組中，可細分兩亞組，第一亞組為南圣毛祥2-12與番賽-25這兩份樣品，在進化樹圖上，他們親緣關系更為靠近;其他26份樣品歸為第二亞組。這一結果可為五指山市野生茶樹新分類群的建立提供了分子水平的證據。

4 ?結論

通過植物形態特征和DNA序列鑒定技術相互結合起來對五指山野生茶進行鑒定與分類，為五指山野生茶新分類群的建立提供了分子水平的證據。總體上看，五指山野生茶在形態特征上更接近普洱茶。以psbA-trnH葉綠體編碼序列鑒定結果表明，3種茶應是并列的，或者說，普洱茶和白毛茶還更接近一些，所有8個居群的五指山野生茶樣品都較接近，獨立于普洱茶和白毛茶。因此，我們認為五指山野生茶是茶（原變種）的另一個變種，命名為海南五指山水滿茶（Camellia sinensis var. shuiman F. Su and X. B. Yang），簡稱水滿茶。

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