高溫脅迫對德爾卑沙門氏菌抗逆性的影響

翟立公 杜傳來 楊 晴 陳 晨 王俊穎

(安徽科技學院，安徽 滁州 233100)

在世界范圍內，每年由沙門氏菌引起的食物中毒事件達到8 030萬件，造成15.5萬人死亡[1]；在中國，細菌性食物中毒事件中，70%～80%是由沙門氏菌引起的[1-3]。沙門氏菌感染人體后潛伏期短，發病突然，能引起感染者的腹瀉、發熱等癥狀，嚴重者會引起菌血癥[4]。沙門氏菌致病主要是通過食源性感染引起的，全球沙門氏菌病病例中有85.6%是食源性感染[5]。沙門氏菌包括2 600多個血清型，但污染食品的血清型主要集中在腸炎沙門氏菌亞種中的部分血清型[6]。德爾卑沙門氏菌(SalmonellaDerby)在中國的豬肉、雞肉類食品中檢出率較高[7-8]。食品在加工過程中，不同脅迫條件的復合作用，有助于提高食源性致病菌的抵抗能力，降低殺菌效果，將引起重要的食品安全問題[9]。Fong等[10]發現，當沙門氏菌經過亞致死(45 ℃、3 min)處理后，其耐熱性明顯提高。有研究[10-12]表明，熱適應性沙門氏菌對UV輻射的抗性增加；當沙門氏菌處于干燥環境下，其高溫的耐受性也會相應增強。經過亞致死高溫脅迫能改變沙門氏菌毒性基因的表達，提高宿主細胞的被感染率[13]。

在食品加工及貯藏過程中，沙門氏菌會受到多種脅迫因子的交叉協同作用，造成其對環境耐受性的改變。研究[14]發現，酸適應性沙門氏菌當遇到低溫、高溫、高滲等環境下，其存活率顯著高于非適應性菌，但對NaClO等消毒劑卻更為敏感。在食品加工過程中，加熱處理是最常用的一種滅菌手段，可有效消除食品及加工器具上的食源性致病菌，防止致病菌的傳播。當加工過程中加熱溫度及時間未達到滅菌要求時，會造成污染的沙門氏菌處于亞致死狀態，促使其開啟熱脅迫應答機制維持其正常的生命活動，從而提高其對高溫脅迫的耐受性[15]。然而，在食品加工過程中沙門氏菌常處于多種脅迫因子的共同作用。因此，針對高溫耐受沙門氏菌對其他脅迫因子交叉抗性的研究將變得非常重要。本試驗擬以德爾卑沙門氏菌(SD)為對象，主要研究沙門氏菌經高溫脅迫后，對其他環境脅迫因子的耐受性影響，為食品加工業針對高溫耐受沙門氏菌選擇合適滅菌、保藏技術提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

德爾卑沙門氏菌(S. Derby)：中國醫學微生物菌種保藏中心(CMCC50719)。

檸檬酸、NaClO：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；

乙酸、NaCl、30%過氧化氫、乙醇(95%)：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；

LB培養基：青島海博生物技術有限公司；

胰蛋白酶大豆蛋白胨培養基(TSB)：青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

二級生物安全柜：BSC-1100ⅡA2-X型，濟南鑫貝西生物技術有限公司；

臺式恒溫培養箱：THZ-92A型，上海躍進醫療器械有限公司；

智能恒溫恒濕培養箱：LHP-160型，上海三發科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 德爾卑沙門氏菌高溫耐受株馴化 德爾卑沙門氏菌(CMCC50719)經LB液體培養基活化后，劃線培養，挑取單菌落，轉接到LB液體培養基，43 ℃、180 r/min培養36 h，再接到LB固體培養基，43 ℃培養，如此反復進行多輪馴化。將馴化獲得的高溫耐受菌株和對照菌株分別接入LB液體培養基，37 ℃、180 r/min培養10 h，平板菌落計數法獲得以上菌株的初始濃度。同時，各取1 mL培養液，10 000 r/min離心1 min，棄上清，分別加入1 mL無菌生理鹽水，重懸。將兩管菌液置于55 ℃，處理20，25，30 min，用無菌生理鹽水10倍梯度稀釋，取適宜稀釋度平板菌落計數。按式(1)計算存活率，評價德爾卑沙門氏菌高溫耐受株的耐受性[14]。

存活率=(處理后菌落數對數值/處理前菌落數對數值)×100%。

(1)

1.3.2 高溫耐受穩定性分析 將德爾卑沙門氏菌高溫耐受菌株連續培養10代，經55 ℃水浴，處理30 min，測定高溫耐受菌株和對照菌株的存活率。

1.3.3 高溫耐受SD菌株環境脅迫抗性分析 高溫耐受菌株和對照菌株，分別經LB液體培養基，過夜培養，取1 mL 菌液離心，棄上清，根據以下方法處理，測定高溫耐受SD的環境脅迫性分析。酸脅迫：用檸檬酸或乙酸分別將生理鹽水的pH調整到2.4，3.0，各取1 mL加入，重懸菌體(處理30 min)；堿脅迫：用NaOH將生理鹽水的pH調整至10，11，12，各取1 mL加入，重懸菌體(處理30 min)；乙醇脅迫：配置60%，65%，70%的乙醇溶液，各取1 mL加入，重懸菌體(處理3 min)；過氧化氫脅迫：將30% H2O2與無菌水配置成25，75，125 mmol/L的溶液，各取1 mL，重懸菌體(處理30 min)；次氯酸脅迫：用無菌水分別配置0.1%，0.5%，1.0%NaClO溶液，各取1 mL，重懸菌體(處理15 min)；低溫脅迫：用1 mL生理鹽水重懸菌體后，置于-20 ℃冰箱冷凍處理22 d。以上菌體經過環境脅迫處理后，10 000 r/min離心1 min，棄上清液，加入1 mL生理鹽水重懸，利用平板菌落計算法對脅迫前后菌落計數，計算脅迫后菌體存活率。

1.3.4 數據統計分析 每組試驗設3次重復，利用SPSS 19.0和Origin 7.0軟件對數據進行分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1 高溫耐受SD菌株馴化及高溫耐受穩定性

SD經長時間43 ℃馴化培養，獲得的菌株，在55 ℃脅迫條件下的存活率如圖1所示。當脅迫時間僅為20 min 時，高溫耐受菌株的存活率達到61.9%，而對照菌株的存活率僅達到41.19%，差異顯著；當脅迫時間增加到25 min后，高溫耐受菌株的存活率也顯著高于對照菌株；但隨著脅迫時間的延長，馴化菌株的存活率略高于對照菌株。表明經高溫馴化后，對高溫脅迫的耐受性具有脅迫時間的相關性，隨著脅迫時間延長，耐受性降低。

*表示差異顯著(P<0.05)

Figure 1 Survival rate of high temperature SD resistant strain and control strain at 55 ℃ for different treatment time

高溫耐受菌株和對照菌株分別經10次傳代后，在55 ℃ 脅迫條件下，高溫耐受菌株的存活率為47.3%仍高于非耐受菌株的38.73%，該結果表明，馴化后的菌株仍保持較好的高溫耐受性。

2.2 高溫耐受SD菌株酸脅迫抗性

利用檸檬酸或乙酸配置pH 3.0，2.4的無菌生理鹽水溶液，重懸高溫耐受菌株和非高溫耐受菌株，室溫放置30 min，存活率結果見圖2。當菌體處于檸檬酸配置的pH 3.0脅迫條件下，高溫耐受菌株和非高溫耐受菌株的存活率均最高，但馴化后菌株的存活率(97.79%)仍高于未被馴化的菌株(85.91%)。當處于pH 3.0環境下，檸檬酸處理后的高溫耐受菌株和對照菌株的存活率要高于乙酸處理后的高溫耐受菌株和對照菌株，表明在此條件下乙酸對SD的殺菌效果更好。當菌株處于pH 2.4脅迫條件下，檸檬酸處理的高溫耐受菌株的存活率略高于非高溫耐受菌株的存活率；乙酸處理后，非高溫耐受菌株完全滅活，高溫耐受菌株的存活率達到46.7%，具有顯著性。以上結果表明，SD的高溫耐受性增強，同時也提高了對酸環境脅迫的抗性。但有研究[16]結果顯示，當沙門氏菌長期處于低酸環境，反而降低沙門氏菌對高溫的耐受性。

2.3 高溫耐受SD菌株堿脅迫抗性

如圖3所示，當沙門氏菌處于低堿環境下，高溫耐受菌株和對照菌株的存活率均較高；在pH 10脅迫條件下，對照菌株(91.02%)的存活率僅高于高溫耐受菌株(86.21%)存活率4.81%，差異不顯著；在pH 11脅迫條件下，高溫耐受菌株和對照菌株存活率相差7.16%，與pH 10 脅迫條件的結果相似。當SD處于pH 12時，對照菌株的存活率下降明顯達到33.83%，而高溫耐受菌株甚至全部死亡。該結果表明，高溫耐受SD對堿環境較為敏感，其抗性較差，可以采取堿處理方式提高對高溫耐受SD的滅菌效果。

*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著

Figure 2 Survival rate of high temperature resistant SD strain and non-high temperature resistant strain at acid stress

圖3 高溫耐受SD菌株和非高溫耐受菌株在堿脅迫的存活率

Figure 3 Survival rate of high temperature resistant SD strain and non-high temperature resistant strain at alkaline stress

2.4 高溫耐受SD菌株乙醇脅迫抗性

在相同脅迫時間下，乙醇濃度從60%增加到65%時，對照菌株和高溫耐受菌株的存活率均大幅下降，對照菌株和高溫耐受菌株的存活率分別下降了47.03%，39.66%。當60%乙醇脅迫時，對照菌株的存活率(82.93%)是高溫菌株存活率(66.04%)的1.26倍，差異顯著；當65%的乙醇溶液短時處理后，對照菌株的存活率(35.90%)是高溫耐受菌株存活率(26.38%)的1.36倍，差異顯著。但當處于65%，70%乙醇濃度時，高溫耐受菌株存活率變化較小。本研究發現，高溫耐受SD對乙醇的敏感度更大，且隨著乙醇濃度的升高，其消毒效果也更加明顯。但有研究[17]表明，沙門氏菌經低濃度的酒精(5%)脅迫，有助于提高腸炎沙門氏菌的酒精耐受性，但對55 ℃高溫脅迫影響較小。當微生物的脅迫順序發生改變，將直接影響沙門氏菌的耐受性。

*表示差異顯著(P<0.05)

Figure 4 Survival rate of high temperature resistant SD strain and non-high temperature resistant strain at ethanol stress

2.5 高溫耐受SD菌株過氧化氫脅迫抗性

過氧化氫利用活性氧的氧化能力，破壞原生質體，實現對微生物消毒滅菌的目的，多用作食品及加工器械的消毒劑[18]。如圖5所示，隨著環境中H2O2濃度的提高，高溫耐受菌株的存活率影響不大，基本穩定在90%左右；但對對照菌株的存活率影響較大，當H2O2濃度從75 mmol/L 提升到125 mmol/L時，對照菌株的存活率下降了27.76%。以上結果表明，高溫脅迫有助于提高SD對H2O2氧化脅迫的耐受性，降低H2O2對SD的消毒滅菌效果。劉佳玫等[14]發現酸適應性海德爾堡沙門氏菌對H2O2的耐受性增強。

**表示差異極顯著(P<0.01)

Figure 5 Survival rate of high temperature resistant SD strain and non-high temperature resistant strain at H2O2stress

2.6 高溫耐受SD菌株次氯酸鈉脅迫抗性

選用0.1%，0.5%，1.0%的次氯酸鈉溶液對高溫耐受菌株脅迫處理，結果見圖6。在不同濃度NaClO溶液處理30 min，高溫耐受菌株的存活率低于對照菌株。該結果表明，經高溫耐受性處理后SD對NaClO的敏感性增加，增加了高溫耐受菌株的死亡速率。有研究[19]發現，酸適應性鼠傷寒沙門氏對NaClO脅迫條件的敏感性也有顯著提高。通過高溫和酸處理，有助于提高NaClO對SD的滅菌效果。

2.7 高溫耐受SD菌株冷凍脅迫抗性

-20 ℃冷凍保藏是食品冷藏，延長貨架期常用的一種食品保藏手段。將SD高溫耐受菌株和對照菌株放置-20 ℃冰箱冷凍保藏2～22 d，測定兩種菌株的存活率，結果見圖7。當冷凍2 d時，對照菌株存活率(65.86%)下降明顯，相比于高溫耐受菌株的存活率(89.7%)下降了23.83%，差異極顯著；隨著冷凍時間延長到13 d，對照菌株存活率基本保持穩定，但延長到22 d時，對照菌株的存活率下降到46.22%。在相同時間的冷凍脅迫下，高溫耐受菌株的存活率均高于對照菌株的存活率。該結果表明，未經過高溫處理的SD對冷凍脅迫較為敏感，高溫脅迫能夠增加SD對低溫冷凍環境的抗性。

圖6 高溫耐受SD菌株和非高溫耐受菌株在NaClO脅迫的存活率

Figure 6 Survival rate of high temperature resistant SD strain and non-high temperature resistant strain at NaClO stress

*表示差異顯著(P<0.05)

Figure 7 Survival rate of high temperature resistant SD strain and non-high temperature resistant strain at low temperature stress

3 結論

沙門氏菌的最適生長溫度在37 ℃，本研究在43 ℃條件下進行傳代培養，經過多輪馴化后發現該菌株在55 ℃ 處理下的存活率明顯高于對照菌株。因此，在實際生產過程中，為達到消毒滅菌的效果，應采取足夠的溫度和時間進行處理。

當沙門氏菌暴露在壓力環境下能產生對其他脅迫條件的聯合耐受性[20-21]。本試驗揭示了高溫耐受菌株對其他食品加工、貯藏等脅迫環境下的存活狀態，當沙門氏菌經過高溫馴化后，對低酸、低溫和H2O2等脅迫條件具有較好的耐受性，但對乙醇、堿和NaClO等環境的耐受性降低。沙門氏菌經高溫脅迫后，啟動自身的熱脅迫抗性調節網絡，能夠維持細胞正常的生命活動，但對其他環境脅迫的耐受性表現存在較大差異。因此，對熱抗性的調控機制仍有待進一步的深入研究。