免疫防控小龍蝦白斑綜合癥病毒試驗(yàn)

雷曉中 石義元 朱代宏

摘要：白斑綜合癥病毒（White spot syndrom）是引起小龍蝦（Procambarus clarkii）暴發(fā)性死亡的主要病原體。使用湖北某公司生產(chǎn)的免疫調(diào)節(jié)劑試驗(yàn)樣品，經(jīng)室內(nèi)免疫試驗(yàn)及稻田免疫試驗(yàn)。結(jié)果表明，室內(nèi)免疫試驗(yàn)組存活率達(dá)到86.7%，防治效果為90.38%;稻田免疫試驗(yàn)中，在白斑病毒暴發(fā)高峰時(shí)期使用免疫調(diào)節(jié)劑可以有效減少小龍蝦的死亡率，提高其產(chǎn)量。免疫調(diào)節(jié)劑對(duì)于預(yù)防、控制小龍蝦白斑綜合癥病毒具有顯著效果和經(jīng)濟(jì)效益。

關(guān)鍵詞：小龍蝦（Procambarus clarkii）;白斑病毒綜合癥;免疫調(diào)節(jié)劑

中圖分類號(hào)：S9? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）10-0118-03

Abstract： White soptesyndrom virus is the main pathogen causing crayfish death. The immunomodulator test sample produced by a company in Hubei province. The results showed that the survival rate of the indoor immunization group reached 86.7%，and the control effect reached 90.38%; In the field experiment， the use of immunomodulators during the peak period of white spot virus outbreak can effectively reduce the mortality of crayfish and improve its yield.It shows that the immunomodulator test sample has significant effects and economic benefits for preventing and controlling crayfish white spot virus.

Key words： Procambarus clarkii; white spot virus syndrome; immunomodulator

小龍蝦，學(xué)名克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），原產(chǎn)于北美洲，20世紀(jì)30年代傳入中國(guó)，現(xiàn)已成為中國(guó)重要養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)蝦類。21世紀(jì)以來(lái)，小龍蝦養(yǎng)殖發(fā)展迅猛，消費(fèi)市場(chǎng)持續(xù)放大，產(chǎn)業(yè)鏈不斷延伸，逐步形成了集苗種繁育、健康養(yǎng)殖、加工出口、餐飲物流、節(jié)慶文化于一體的產(chǎn)業(yè)鏈條。特別是“十二五”以來(lái)，由于有較高的經(jīng)濟(jì)效益、廣闊的市場(chǎng)前景、良好的發(fā)展態(tài)勢(shì)，很多地區(qū)將小龍蝦產(chǎn)業(yè)作為地方特色主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)進(jìn)行打造，小龍蝦產(chǎn)業(yè)化步伐進(jìn)一步加快、產(chǎn)業(yè)發(fā)展水平進(jìn)一步提升，在培育地方經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)新動(dòng)能、推進(jìn)漁業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革、促進(jìn)漁業(yè)增效和漁民增收過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

近年來(lái)，隨著小龍蝦養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，小龍蝦白斑綜合癥病毒（Crayfish white spot syndrom virus，WSSV）所引起的小龍蝦白斑綜合癥病毒在湖北、湖南、安徽、江西、江蘇、浙江等地年年暴發(fā)。WSSV感染初期的小龍蝦表現(xiàn)為厭食少動(dòng)，感染中期表現(xiàn)為對(duì)外界反應(yīng)遲鈍，不攝食;后期，附肢無(wú)力，無(wú)法支撐身體，血淋巴變得稀薄且不易凝固，3～10 d內(nèi)死亡率可達(dá)90%，對(duì)小龍蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重地制約了小龍蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展[1]。白斑綜合癥病毒的宿主范圍較廣，所有的人工養(yǎng)殖對(duì)蝦都是WSSV的敏感宿主（南美白對(duì)蝦、中國(guó)對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦、日本對(duì)蝦、墨吉對(duì)蝦 、長(zhǎng)毛對(duì)蝦、短溝對(duì)蝦 、羅氏沼蝦、脊尾白蝦），包括小龍蝦、河蟹也可被WSSV感染。目前普遍認(rèn)為WSSV存在兩種傳播途徑，一是水平傳播途徑;二是垂直傳播途徑。水平傳播主要是經(jīng)口傳播，即受污染的飼料、浮游微藻、帶病毒個(gè)體排泄物、受感染死亡的動(dòng)物殘?bào)w都可能成為感染源[2-4]。垂直傳播是親代向子代的傳播。宋曉玲等[5]、包振民等[6]對(duì)蝦進(jìn)行人工感染研究時(shí)發(fā)現(xiàn)蝦的卵細(xì)胞中存在病毒，采用全池潑灑聚維酮碘、恩諾沙星等常規(guī)方法來(lái)控制病情，其效果微乎其微。為了探索新的防治手段和方法，本研究采用口服免疫調(diào)節(jié)劑方法，在湖北省荊門市進(jìn)行了試驗(yàn)，現(xiàn)將具體情況報(bào)告如下。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

“免疫調(diào)節(jié)劑”由湖北肽洋紅生物工程有限公司提供。試驗(yàn)場(chǎng)地為荊門市沙洋縣培昌稻蝦養(yǎng)殖專業(yè)合作社、荊門市同鑫農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司、荊門市沙祥縣晨光稻蝦養(yǎng)殖專業(yè)合作社、荊門市百里泉水養(yǎng)殖專業(yè)合作社、荊門市漳河新區(qū)新霖水稻專業(yè)合作社。室內(nèi)試驗(yàn)中的小龍蝦購(gòu)自梁子湖水產(chǎn)市場(chǎng)。WSSV來(lái)源于廣西北海養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病南美白對(duì)蝦，經(jīng)過(guò)小龍蝦活體增殖后提純，-70 ℃保存。

1.2? 室內(nèi)免疫試驗(yàn)

將體重20～25 g健康的小龍蝦分為試驗(yàn)組、對(duì)照組、正常對(duì)照組，30只/組，每組各兩個(gè)重復(fù)。小龍蝦從市場(chǎng)購(gòu)進(jìn)后，先經(jīng)PCR抽樣檢查，WSSV陰性為試驗(yàn)用蝦。試驗(yàn)蝦在室溫為22～25 ℃加有3 cm水的塑料盒內(nèi)養(yǎng)殖，在室內(nèi)穩(wěn)定3 d后，試驗(yàn)組使用免疫調(diào)節(jié)劑，1 g樣品拌75 g飼料投喂7 d后，用經(jīng)注射小龍蝦白斑綜合癥病毒致死的新鮮小龍蝦組織塊投喂;對(duì)照組使用相同飼料但不使用免疫調(diào)節(jié)劑，投喂7 d后，用經(jīng)注射小龍蝦白斑綜合癥病毒致死的新鮮小龍蝦組織塊投喂。正常對(duì)照組使用相同飼料持續(xù)投喂，持續(xù)25 d記錄小龍蝦的死亡情況。防治效果=[1-（試驗(yàn)組試驗(yàn)前個(gè)數(shù)×對(duì)照組試驗(yàn)后存活數(shù)/試驗(yàn)組試驗(yàn)后存活數(shù)×對(duì)照組試驗(yàn)前存活數(shù)）]×100。

1.3? 稻田免疫試驗(yàn)

2018年4月10日至5月10日，在荊門5個(gè)稻田養(yǎng)蝦基地中，每公頃使用50 g免疫調(diào)節(jié)劑，加適量水拌料投喂，連續(xù)投喂3 d（1 次/d），1周后每隔7 d投喂1次，共投喂3次，5月底收蝦。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 室內(nèi)免疫試驗(yàn)結(jié)果

由表1可以看出，經(jīng)過(guò)25 d的養(yǎng)殖，投喂免疫調(diào)節(jié)劑試驗(yàn)組存活率達(dá)到86.7%。未投喂免疫調(diào)節(jié)劑的對(duì)照組在投喂帶有WSSV病毒的組織塊后第25 d累計(jì)死亡55只，防治效果為90.38%。

2.2? 稻田免疫試驗(yàn)結(jié)果

稻田免疫試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，5家小龍蝦養(yǎng)殖合作社經(jīng)過(guò)1個(gè)月拌料投喂使用免疫調(diào)節(jié)劑，對(duì)比往年小龍蝦白斑綜合癥病毒暴發(fā)時(shí)期常規(guī)全池潑灑聚維酮碘，產(chǎn)量分別提高了10.9%、37.0%、35.0%、39.0%、37.0%。在白斑綜合癥病毒暴發(fā)高峰時(shí)期使用免疫調(diào)節(jié)劑可以有效減少小龍蝦的死亡率，從而大幅度提高產(chǎn)量。

3? 討論

3.1? 白斑綜合癥的危害性和免疫防控的重要性

本試驗(yàn)所用的免疫調(diào)節(jié)劑是通過(guò)生物工程菌表達(dá)的一種口服TAT-VP28工程蛋白，生產(chǎn)工藝采取發(fā)酵-菌體破碎-變復(fù)性-膜濃縮-冷凍干燥-復(fù)配定量制備而成。

目前，人們普遍認(rèn)為甲殼類動(dòng)物體內(nèi)只有非特異免疫系統(tǒng)，而沒(méi)有像脊椎動(dòng)物那樣復(fù)雜的特異性免疫系統(tǒng)。研究表明，脂多糖（Lipopolysaccharides）[7]、葡聚糖（Glucan）[8]、肽聚糖（Peptidoglycan）[9]等物質(zhì)可以激活蝦體內(nèi)的酚氧化酶系統(tǒng)，顯著提高血淋巴中吞噬細(xì)胞的吞噬能力，同時(shí)能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗菌類物質(zhì)，從而提高機(jī)體的非特異性免疫，增強(qiáng)其抗病原微生物感染的能力。血藍(lán)蛋白作為甲殼類動(dòng)物的重要先天性免疫系統(tǒng)，在甲殼類動(dòng)物抗病原微生物中起到了極其重要的作用，有研究證實(shí)上調(diào)蝦體內(nèi)血藍(lán)蛋白表達(dá)水平可以推遲或抑制WSSV在其體內(nèi)的復(fù)制。VP28工程蛋白具有與病毒競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞受體的功能和提高蝦非特異免疫功能的能力。

該樣品中的工程蛋白VP28攜帶有TAT跨膜域，能將VP28經(jīng)口服帶入蝦體內(nèi)，誘導(dǎo)小龍蝦體內(nèi)產(chǎn)生超氧化物歧化酶（SOD）、酚氧化酶（PO）非特異性免疫反應(yīng)，起到抗病毒的作用。此外，TAT-VP28工程蛋白能與蝦腸道細(xì)胞受體結(jié)合，從而封閉病毒的感染通路，形成一道阻礙病毒感染的屏障，達(dá)到預(yù)防控制小龍蝦白斑綜合癥病毒的目的[10]。

3.2? 免疫預(yù)防應(yīng)配合運(yùn)用水質(zhì)管理、生態(tài)調(diào)控、放養(yǎng)控制等綜合措施

免疫預(yù)防的同時(shí)，好的水質(zhì)、生態(tài)調(diào)控合理、密度合適是預(yù)防白斑綜合癥病毒的重要條件。池塘放苗之前應(yīng)用生石灰消毒，同時(shí)清理野雜魚(yú)[11]。池塘栽植沉水性水生植物，如伊樂(lè)藻、輪葉黑藻、金魚(yú)藻、馬來(lái)眼子菜、苦草等。水面培植水葫蘆、水花生、小浮萍等漂浮性水生植物，水花生不超過(guò)池塘面積的30%，由固定桿定點(diǎn)，不宜密集連片，如間隔10 m。投放蝦苗應(yīng)控制合理密度，中小規(guī)格蝦苗，3 cm，300～500尾/kg，放養(yǎng)密度15萬(wàn)～30萬(wàn)尾/hm2;大規(guī)格蝦苗，5 cm左右，300尾/kg以下，放養(yǎng)密度9萬(wàn)～15萬(wàn)尾/hm2。

4? 小結(jié)

室內(nèi)免疫試驗(yàn)和稻田免疫試驗(yàn)的結(jié)果表明，TAT--VP28免疫調(diào)節(jié)劑可以有效預(yù)防小龍蝦白斑綜合癥病毒，該制劑是利用生物高技術(shù)生產(chǎn)，且無(wú)毒無(wú)害，有望成為環(huán)境友好型產(chǎn)品。該樣品通過(guò)跨膜域?qū)崿F(xiàn)了口服就能刺激蝦體內(nèi)的非特異性免疫并能封閉小龍蝦WSSV感染受體從而提高小龍蝦的抗病能力。該技術(shù)使用方法簡(jiǎn)便，可靠，不用打針，解決了魚(yú)蝦群體的免疫方式，打破了近年來(lái)小龍蝦白斑綜合癥病毒無(wú)藥可防可治的局面。本次試驗(yàn)也證明使用“免疫調(diào)節(jié)劑”配合良好的管理可以有效預(yù)防小龍蝦白斑綜合癥病毒和取得較好的經(jīng)濟(jì)效益。

參考文獻(xiàn)：

[1] INOUYE K，MIWA S，OSEKO N，et al. Mass mortality of cultured kuruma shrimp Marsupenaeusjapanicusin Japan in 1993：Electron microscopic evidence of the causative virus[J].Fish pathol，1994，9：149-158.

[2] 何建國(guó)，周化民，姚? 伯，等.白斑綜合癥桿狀病毒的感染途徑和宿主種類[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，38（2）：65-69.

[3] CORSIN F，TURNBULL J F，HAO N V，et al. Risk factors associated with white spot syndrome virus infection in a Vietnamese rice-shrimp farming system[J].Dis Aquat Org，2001，47：1-12.

[4] 黃? 捷，于? 佳，宋曉玲，等.1994年浙江省對(duì)蝦暴發(fā)性流行病病原及傳播途徑的初步調(diào)查[J].海洋水產(chǎn)研究，1995，16（1）：91-98.

[5] 宋曉玲，黃? 健，王崇明，等.皮下及造血組織壞死桿狀病毒對(duì)中國(guó)對(duì)蝦親蝦的人工感染[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，1996，20（4）：374-378.

[6] 包振民，胡景杰，姜? 明，等.桿狀病毒感染越冬親蝦（Penaeuschenesis）的研究——越冬親蝦感染及其垂直傳播的可能性[J].青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，27（3）：347-351.

[7] TAKAHASHI Y，KONDO M，ITAMI T，et al. Enhancement of disease resistance against penaeid acute viraemia and induction of virus-inactivating activity in haemolymph of kurumashrimp，Penaeus japonicus，by oral administration of Pantoea agglomerans lipopolysaccharide（LPS）[J].Fish shellfish immunol，2000，10：555-558.

[8] CHANG C F，SU M S，CHEN H Y. Effect of dietary beta-1，3 glucan on resistance to white spot syndrome virus （WSSV） in postlarval and juvenile Penaeus monodon[J].Dis Aquat Organ，1999，36：163-168.

[9] ITAMI T，ASANO M，TOKUSHIGE K. Enhancement of disease resistance of kuruma shrimp，Penaeus japonicus，after oral administration of peptidoglycan derived from Bifidobacterium thermophilium[J].Aquaculture，1998，164：277-288.

[10] ZHANG Y，NING J F，QU X Q，et al. TAT-mediated oral subunit vaccine against white spot syndrome virus in crayfish[J].Journal of virological methods，2012，181：59-67.

[11] 徐增洪，戴明星，王金勝，等.光伏池塘淡水小龍蝦生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)研究[J].科學(xué)養(yǎng)魚(yú)，2018（8）：38-39.