山東蒼山大蒜貯藏期新病原細菌的分離與鑒定

鐘文文 孟杰 張魯燕 于金英 許俊杰

摘要：對山東省臨沂市蘭陵縣蒼山大蒜貯藏期病害情況進行了調查，從病斑上分離得到4種真菌和1種細菌，經致病性檢測發現細菌菌株LYU20170013號具有致病性。采用柯赫氏法則和病斑顯微觀察法對病原菌菌株LYU20170013進行了驗證。通過形態學特征和16S rRNA序列分析，將LYU20170013菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。該菌在大蒜鱗莖上尚屬首次報道。

關鍵詞：解淀粉芽孢桿菌;大蒜鱗莖病害;柯赫氏法則;病原菌

中圖分類號： S432.4+2;S436.33? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）10-0205-04

大蒜（Allium sativum）是著名的兼有藥效的蔬菜，屬百合科蔥屬多年生草本植物，以鱗莖入藥，具止痢、止咳、健胃、殺菌、驅蟲之功效，原產中亞，南、北各省均有栽植，栽培歷史悠久[1]。蒼山大蒜也稱作“蘭陵大蒜”，亦稱“葫”或“葫蒜”，產于“中國蒜鄉”山東省臨沂市蘭陵縣，蒼山大蒜歷史悠久，東漢崔實著《東觀漢記》載：“李恂，為兗州刺史，所種小麥、葫蒜，悉付從事，無所留”。它是在蘭陵縣特定的生態環境條件下，經過長期的自然選擇和人為定向培育而形成的蘭陵特有品種，為山東省傳統名特蔬菜之一，是中國出口的優質大蒜。

蒼山大蒜外貿出口已有20多年歷史，遠銷日本、韓國、新加坡、馬來西亞、柬埔寨、泰國等國家和地區。2016年“蒼山大蒜”榮獲農產品地理標志金獎，成為山東省唯一一個獲得此獎項的產品。蒼山大蒜基地現有面積2.4萬hm2，東至臨沂市蘭陵縣神山鎮東楊莊村;西至向城鎮楊莊村;南至長城鎮前蘆洼子村;北至大仲村鎮泉汪村;轄10個鄉鎮560個行政村，地理坐標為117°56′～118°17′E、34°39′～34°59′N。年產量32萬t。

蒼山大蒜隨著種植面積的逐年擴大，大蒜有害生物亦呈快速增加趨勢，危害越來越大。在大蒜生長期間和倉儲期間，有害生物的危害，造成蒜薹、蒜頭減產和霉爛[2]。蒜頭（大蒜鱗莖）在貯藏調運期間可發生多種病害，引起蒜頭腐爛和污損，嚴重降低其商品價值和種用價值。大蒜鱗莖（蒜頭）是重要的市場和產地檢疫農產品[3]，蒜頭病害還是出境植物檢疫的重要對象，鱗莖腐爛是引起大蒜減產的主要因素[4]。因此，進一步加強大蒜貯藏期病害的研究有著重要的意義。本研究旨在通過對大蒜貯藏期蒜瓣新病害病原細菌的研究，為大蒜病害的防控提供理論依據和指導。

1 材料與方法

1.1 病害調查和樣本采集

2016年1月至2017年11月對臨沂市蘭陵縣大蒜貯藏期病害情況進行調查，發現蒼山大蒜在貯藏期間發生較為嚴重的病害，對感病情況、病原種類及發生癥狀進行觀察、記錄和拍照。采集大蒜鱗莖樣本650份，統計蒜頭和蒜瓣感病率，并選取部分蒜瓣進行病原菌研究。

1.2 病原菌的鑒定

1.2.1 病原菌的分離和純化 病原菌的分離采用內生細菌的分離方法進行分離，將得到的分離物分別編號，并置于細菌培養基上于37 ℃恒溫培養1～2 d，在顯微鏡下觀察，待單細胞形態特征完全一致時，即轉接到細菌斜面培養基上進行培養，得到的菌株為純菌株。

1.2.2 病原細菌的常規生理生化特性測定 傳統形態和生理生化鑒定：通過革蘭氏染色、觀察形態和使用細菌微量生化鑒定管測定生理生化特性。根據《伯杰氏細菌手冊》[5]和《常見細菌鑒定手冊》[6]中的方法進行種類鑒定。細菌微量生化鑒定管購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司。

1.2.3 致病性測定 分別以病原菌的菌落和孢子懸浮液作為接種體對其在蒜瓣上的致病性進行測定。選擇健康的蒜瓣進行接種，蒜瓣先用70%的乙醇表面消毒，再分有傷口（用無菌新牙刷在蒜瓣表面刷3下）接種和無傷口接種，以清水為對照，接種后保濕24 h，每隔1～2 d觀察癥狀。發病后，從病斑再次分離病原菌，并與原接種菌進行比較。Kock氏致病性測定參照Xie等的方法[7]進行。

1.2.4 病原菌的確認 蒜瓣組織解剖觀察：選取含有病斑的蒜瓣，用清水沖洗干凈，然后再用無菌水洗1～3遍，保證蒜瓣表面沒有其他微生物和塵土顆粒附著。利用徒手切法，采用縱向和橫向的方法切取病斑及其周圍的組織，選取合適材料制成玻片，用于病原菌的顯微觀察和驗證。

1.2.5 病原菌形態學的特征觀察 病原菌的培養性狀觀察：將病原菌移接于PDA平板上，25 ℃培養7～8 d，記錄菌落形態和顏色，觀察其菌落特征和大小，并描述其菌落特征。

1.2.6 16S rDNA同源性分析 采用OMEGA細菌DNA提取試劑盒/Bacterial DNA Kit（50次）提取菌株基因組總DNA。本試劑盒購自上海聯碩生物科技有限公司。引物設計上游引物5′-GGATACCTTGTTACGACTT-3′和下游引物5′-AGAGTTTGATCCTGCCTCAG-3′，PCR擴增反應體系：10×buffer 2.5 μL，dNTP 2.5 μL，引物各1.0 μL，DNA模板 5.0 μL，Taq DNA Polymerase 0.5 μL，ddH2O 12.5 μL。PCR產物經回收純化后連入pMD19-T載體，熱激法轉化到E. coli DH5α感受態細胞，選擇轉化的陽性克隆提取質粒，由山東省農業科學院測序中心進行DNA雙向測序。利用DNAMAN分析軟件將待測菌株的16S rDNA核苷酸序列與GenBank上收錄的代表菌株16S rDNA基因核苷酸序列進行同源性比對。結合DNAMAN、GenBank BLAST軟件，構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 蒜瓣的病害與癥狀特點

2016年1月至2017年11月對蒼山縣采收的新鮮大蒜、市售大蒜和倉儲大蒜進行了抽樣調查，調查發現儲藏期大蒜蒜頭病害種類復雜，病害發生較為嚴重，嚴重影響大蒜的質量和蒜農的收益。其發生規律和危害癥狀不盡相同。感病情況統計結果表明，蒜頭感病率10%，蒜瓣感病率6%，真菌發病感病率95%，細菌感病率5%。從感病癥狀可知，蒜瓣病斑多呈干癟、凹陷、水漬狀，常覆蓋絨毛或者粉狀物，且顏色各不相同，有青色、黑色、白色、褐色等。發病蒜瓣有時散發惡臭味?？傊?，大蒜鱗莖受害后的癥狀因為病原物的不同各有不同。調查還發現，凡是感病蒜瓣多有機械損傷痕跡，由此說明貯藏期大蒜感病的主要原因是：蒜瓣自身在田間、運輸或者貯藏過程受到了機械損傷，導致腐生菌寄生所致。造成根部腐爛的主要原因是根部帶菌浸染，初侵染菌源多來自田間土壤;在貯運期間由根部蔓延到蒜頭基部，蒜瓣變黃褐色、干枯。貯運病害發生的主要內在因素是蒜頭內在質量較差，生活力降低或收獲貯運期間受到機械損傷。大部分貯蒜病害的病原菌腐生性較強，分布很廣，蒜頭不論在田間還是在貯運過程中都要被病原菌污染，貯藏期間通風不暢，蒜頭受潮發熱，則是主要的外部因素。做好田間病害防治，保持貯運環境衛生，避免采收、運輸和貯藏期機械損傷，減少菌源來源無疑是極其重要的。采收、貯運條件對蒜頭病害的發生起著關鍵作用。

2.2 病原菌的鑒定

2.2.1 病原菌的分離和純化 從蘭陵縣、臨沂市場和超市采集樣品650份，從中選取30個代表性蒜瓣，于PDA培養基平板上分離病原菌，25 ℃下培養，各標樣均長出不同的菌落，通過菌落特征和顯微特征觀察，參照有關資料，將大蒜蒜瓣病斑分離物初步鑒定為5種，并分別編號為LYU20170011～LYU20170015，其菌落形態分別見圖1-A至圖1-E。初步擬定為：A曲霉Aspergilus sp.，B青霉Penicillium sp.，C芽孢桿菌Bacillus sp.，D、E鐮刀菌Fusarium spp.。以上分離物的屬種歸屬和致病性需要進一步驗證。本研究只對芽孢桿菌Bacillus sp. LYU20170013菌株進行深入研究，其他分離物的致病性尚在研究之中。

2.2.2 理化性質的鑒定 從大蒜蒜瓣分離得到的12株菌株，在PDA或者牛肉膏蛋白胨細菌培養基上其菌落特征完全一致。菌落呈不規則狀，有皺褶，邊緣波紋狀或者鋸齒狀，灰白色，革蘭氏染色陽性，接觸酶試驗、木糖發酵、乳糖發酵、棉子糖發酵、硝酸鹽還原試驗均呈現陽性，V-P試驗陽性，酪素水解試驗、淀粉水解陽性，麥芽糖發酵試驗和甘露醇發酵試驗均呈現陽性，能在7% NaCl中生長，兼性厭氧。以上特征與解淀粉芽孢桿菌Bacillus sp.的理化性質最為類似，故將其擬定為解淀粉芽孢桿菌。

2.2.3 病原菌的確認 柯赫氏法則驗證：將純化后的細菌菌株LYU20170013重新接種到健康的大蒜蒜瓣上，回接在 35 ℃ 下恒溫培養7～9 d，觀察發現接種的大蒜蒜瓣全部發病，有刺傷的蒜瓣發病比無刺傷的蒜瓣早1～2 d，癥狀與田間觀察到的相同，對照不發病（圖2）。用發病的病斑進行常規分離，再次獲得與原分離菌基本一致的病原菌，根據柯赫氏法則，證明接種菌即為大蒜蒜瓣的病原菌。

2.2.4 病原菌的形態特征 自然基質組織解剖觀察：選取含有病斑的大蒜蒜瓣，用清水沖洗干凈，再用70%的乙醇浸泡 1～3 min，無菌水洗1～3遍，保證葉片表面沒有其他微生物和塵土顆粒附著。利用徒手切法，采用縱向和橫向的方法切取病斑及其周圍的組織，制備組織玻片，進行顯微觀察，結果如圖3。從圖3-A看出，病原菌短桿形，23 μm×（0.6～0.8） μm，單個細胞，著色均勻。感病蒜瓣組織解剖特征見圖 3-B。病原分離物在PDA培養基上菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，菌落邊緣不整齊或者呈鋸齒狀，培養基中生長時，常形成皺醭。菌落形態如圖3-D，挑去菌落，制片觀察，其顯微特征如圖3-C，從圖3-C看出，其形態學特征與自然基質上圖3-A的特征完全一致。

2.2.5 病原菌16S rDNA的序列分析及同源性比較 形態學特征是真菌傳統分類的主要依據。但是，真菌形態學特征受培養基和基質的影響較大，所以單純進行形態學分類還缺乏一定的科學性。為保證病原菌鑒定的準確性，本研究對得到的幾種病原分離物進行了分子生物學輔助鑒定。對LYU20170013號細菌進行了16S rRNA序列測定。LYU20170013號菌株的PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測如圖4，得到1個大小約1 413 bp的片段基因序列。

將菌株LYU20170013的rDNA-ITS基因序列與GenBank中已有的DNA序列進行同源性比較，構建系統進化樹。由圖5可看出，與其同源性99%的菌株種類為解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens（KR708881.1）、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis（KF475836.1、JQ806052.1、FJ581439.1）、甲基營養型芽孢桿菌Bacillus mthylotrophicus（KX129838.1、CP009679.1、CP023320.1），從系統發育樹可知，該菌與解淀粉芽孢桿菌B. amyloliquefaciens（KJ77953.1）的遺傳距離最近，再結合其形態學顯微特征，最終確定該病原菌為解淀粉芽孢桿菌B. amyloliquefaciens。

3 結論與討論

通過對蒼山大蒜貯藏期蒜頭感病情況調查，發現蒜頭感病率在10%以上 蒜瓣感病率在6%以上。選取代表性感病蒜瓣對病斑菌群進行了分析，共發現5種微生物，其中LYU20170013號菌株為解淀粉芽孢桿菌，其他菌株為真菌，它們分別為青霉、曲霉、變紅鐮刀菌、尖孢鐮刀菌。本研究只對LYU20170013號菌株進行了詳細研究，根據致病性測定和柯赫氏法則，結合形態學特征和分子生物學技術，最后確定病原LYU20170013號菌株為解淀粉芽孢桿菌，該菌在大蒜上尚屬首次報道。其他真菌的致病性正在陸續研究之中。

大蒜病原物多為腐生真菌，少數為細菌，其菌群多為混合菌群。商鴻生等報道了大蒜紅腐病的3種鐮刀菌[8]。盛紅梅等報道了甘肅省大蒜病害14種，其中真菌性病害9種，細菌性病害1種，主要包括：白腐病、白斑病、紫斑病、花葉病、黑頭病、葉霉病、青霉病、煤斑病、銹病、軟腐病等[9]。屈世喜報道山東魯西南地區大蒜生長期主要病害有病毒病、銹病、葉枯病、葉斑病、菌核病、白腐病、細菌性軟腐病等;貯藏期病害主要有青霉病、灰霉病、紫斑病等[10]。大蒜鱗莖細菌性腐爛病菌，除芽孢桿菌和歐文氏菌外，其余病原細菌在國內外尚未見報道[4]，但是，韓國的Qiu等報道在黑蒜加工過程中，大蒜內生枯草芽孢桿菌B. subtilis，甲基營養型芽孢桿菌B. methylotrophicus和解淀粉芽孢桿菌B. amyloliquefaciens是分離得到的7種細菌中的優勢菌群[17]。Kim等報道了Bacillus amyloliquefaciens MJ1-4發酵的Cheonggukjang（清麴醬）中大蒜β-葡萄糖苷酶活性、總酚含量、異黃酮含量及抗氧化活性的變化特點[18]。本研究在此基礎上，確認了大蒜病原細菌LYU20170013號菌株的種類為解淀粉芽孢桿菌，該病原菌在大蒜上尚屬首次報道。

大蒜真菌類疾病，主要危害近地面假莖基部或貯存的鱗莖。嚴重時影響大蒜的產量和質量。大蒜病害主要有大蒜葉枯病、大蒜莖腐病、大蒜紫斑病、大蒜細菌性軟腐病、大蒜灰霉病、大蒜銹病及大蒜病毒病等[11]。本研究首次報道大蒜鱗莖的新病害，病原物為解淀粉芽孢桿菌。

大蒜為百合科蔥屬多年生草本植物，是各國人民喜愛的香辛類蔬菜，在世界各地普遍種植。大蒜不僅是人們常用的安全無毒、無公害、無殘留的調味品，而且是成本低、無毒、無副作用、具有獨特的藥理和營養保健功能，可以有效地預防癌癥的發生[12-15]。大蒜由于具有較高的營養保健和藥用價值而成為國際研究的熱點[16]。解淀粉芽孢桿菌是具有良好生物防治功能的益生菌，廣泛應用于植物病原真菌和細菌的防治[17]，其功能基因組、蛋白組和代謝組學的研究已取得了一定的進展，有關其分類學鑒定、抗菌物質、抗菌機制以及與植物互作、食品領域和動物領域的應用等方面的研究亦較多[18-25]。本研究主要目的是摸清蒼山大蒜貯藏期鱗莖發病的原因和病原物的種類、致病性及其侵染機制，為大蒜病害的防治提供技術支持和理論指導。在本研究的基礎上，有望在不遠的將來開發出能夠有效控制大蒜儲藏期病原菌解淀粉芽孢桿菌的防控技術。

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