苦蕎麥種子與幼苗對疊氮化鈉誘變的響應

劉建霞 張夢麗 李慧 溫日宇

摘要：用疊氮化鈉對苦蕎麥種子進行誘變，確定疊氮化鈉的最佳誘變劑量和時間，檢測誘變后幼苗的生理指標。以晉蕎2號種子為材料，用不同濃度梯度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5 mmol/L）的疊氮化鈉分別處理4、8、12 h，探討苦蕎麥種子的發芽率和相對發芽率。同時，對幼苗的丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）及過氧化物酶（POD）的活性進行檢測。結果表明，疊氮化鈉的濃度為0.8 mmol/L、誘變時間為8 h時，苦蕎麥種子發芽率為49%，相對發芽率為51.04%，接近半致死濃度。疊氮化鈉在低濃度時，苦蕎麥葉片的SOD、POD活性均升高，高濃度時，活性則有所下降。當疊氮化鈉濃度為0.6 mmol/L時，SOD活性達到最大值，當疊氮化鈉濃度為0.8 mmol/L時，POD活性達到最大值。綜合分析可知，疊氮化鈉濃度為0.8 mmol/L、處理時間為8 h為最佳誘變組合。

關鍵詞：疊氮化鈉;誘變;苦蕎麥

中圖分類號： Q945.34;S517.01? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）10-0085-03

苦蕎麥[Fagopyrum tataricum （L.） Gaertn]屬蓼科蕎麥屬雙子葉植物，又稱萬年蕎、野南蕎等[1]，種子外形較長，為三棱形，頭部棱角明顯、尖銳，底部較圓，外表光滑，為灰黑色或黑褐色，沒有光澤[2]。苦蕎麥的生長適應性強，具有耐干旱、耐寒冷、耐酸堿、耐貧瘠以及生育期短的特點，主要分布在西南山區、云貴高原、陜西、山西等地，是我國傳統的小雜糧之一[3]。苦蕎麥的營養價值十分豐富，蛋白質、維生素、微量元素的含量均比其他作物高，開發前景非常廣闊[4];此外，苦蕎麥還具有較高的藥用價值，可以治療胃痛、消化不良、腰腿疼痛、跌打損傷，《本草綱目》中記載：苦蕎麥的性味苦、平、寒，具有益氣力、續精神、利耳目、寬腸健胃的作用[5]。臨床研究表明，苦蕎麥能夠降低血糖血脂，能有效地預防和治療糖尿病。

目前對蕎麥研究最多的是蘇聯，其次是日本、波蘭、南斯拉夫及加拿大[6]。我國蕎麥品種多，資源豐富，但是蕎麥科研起步比較晚，育種技術也比其他作物落后，蕎麥不僅產量低而且很不穩定，品種多而亂，退化嚴重，影響了我國蕎麥在國際市場的競爭力[7]。隨著人們對苦蕎麥營養、保健及藥用價值研究的深入，對苦蕎麥開發利用力度加大，苦蕎麥也漸漸被人們接受，市場上對苦蕎麥的需求量也不斷加大，因此，培育高產、優質、抗逆性強、適應性廣、符合人們要求的苦蕎麥新品種迫在眉睫[8]。

疊氮化鈉（NaN3）是一種常見的化學誘變劑，具有使用效率高、毒性小、價格低廉、容易獲得、對M1的生理損傷小等優點[9]。其等電點pH值為4.18，當用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH值為3，現用現配）溶解疊氮化鈉時，NaN3在溶液中主要產生HN3分子，表現為中性，細胞膜不能將其截留，可以透過細胞膜進入細胞質中，按照堿基替換的方式來影響DNA的正常合成，導致點突變的產生[9]，從而導致基因發生突變，獲得新的變異品種。目前利用疊氮化鈉進行誘變育種的研究較多，在大豆[10]、大麥[11]、小麥[12]等作物上均有應用，而在苦蕎麥誘變育種方面的研究較少，因此，本研究以苦蕎麥種子為材料，利用不同濃度疊氮化鈉對其進行誘變研究，探究種子發芽率及幼苗生理指標的變化，找出疊氮化鈉半致死濃度，獲得最佳誘變濃度與誘變時間組合，以此對苦蕎麥進行快速的遺傳改良，為獲得高產優質的苦蕎麥新品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2017年3月在山西大同大學生命科學學院細胞工程實驗室進行。材料為山西當地苦蕎麥品種晉蕎2號，來源于山西省農業科學院玉米研究所。

1.2 方法

（1）將種子倒入有水的塑膠盆中洗滌數遍，以除去種子表面的灰塵，同時除去水面上漂浮的劣質種子以及草籽等，然后從中選取顆粒飽滿的苦蕎麥種子約6 000粒，將其放入大燒杯中，加入清水在室溫下浸泡約14 h[13]。然后進行種子消毒處理，具體方法如下：在無菌條件下，用75%乙醇浸泡 30 s，然后置于0.1%氯化汞溶液中處理12 min，最后用無菌水漂洗 5～6次，待用[14];將處理好的種子放入20個錐形瓶中，每個錐形瓶100粒，分別用0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5 mmol/L 疊氮化鈉處理4、8、12 h，每個錐形瓶中加入 20 mL 誘變劑，以磷酸緩沖液（pH值為3）處理為對照（CK），然后以同樣的方法將每個誘變處理做2組重復，以保證試驗結果的可靠性[13]。為了去除種子上殘留的疊氮化鈉溶液，需要用硫代硫酸鈉作終止劑對其進行終止誘變處理，具體方法如下：將錐形瓶中的疊氮化鈉誘變劑倒入1個固定容器中，然后加入10 mL 0.1 mol/L Na2S2O3·5H2O洗滌15 min，再用清水對其沖洗5 min[13];處理完成后，將種子轉移到培養皿中，皿內要鋪上2層濾紙以保持濕潤，然后將其放入25 ℃恒溫培養箱中進行培養，定期觀察并統計發芽的種子數[15]，調查7 d時的發芽率。

（2）丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性的測定參考《植物生理學實驗指導》[16]。

1.3 數據處理

采用Excel和SPSS 23對試驗數據進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 疊氮化鈉處理對苦蕎麥發芽率、相對發芽率的影響

由表1可知，疊氮化鈉同一處理時間內隨著處理濃度的增大，各組之間發芽率和相對發芽率均存在顯著差異（P<0.05）。處理時間為4 h時，對照和0.2 mmol/L之間發芽率差異未達到極顯著水平，0.6 mmol/L和0.8 mmol/L之間發芽率差異未達到極顯著水平，其余各組之間發芽率均存在極顯著差異（P<0.01）;除對照和0.2 mmol/L外，其余各組之間相對發芽率均存在極顯著差異（P<0.01）。處理時間為 8 h 時，除0.6、0.8 mmol/L外，其余各組之間發芽率和相對發芽率均存在極顯著差異（P<001）。處理時間為12 h時，各組之間發芽率和相對發芽率均存在極顯著差異（P<0.01）。隨著疊氮化鈉處理時間和濃度的加大，苦蕎麥的發芽率整體呈現出下降的趨勢，當疊氮化鈉的濃度為1.5 mmol/L、處理時間為 12 h 時，發芽率由原來的94%降到3%，種子的相對發芽率也呈現出下降的趨勢，當疊氮化鈉處理濃度達到 1.5 mmol/L、處理時間為12 h時，其相對發芽率由100.00%降到3.19%。在同一濃度下，隨著誘變時間的延長，苦蕎麥種子相對發芽率也表現為下降的趨勢，說明隨著處理濃度和處理時間的增加，苦蕎麥種子受損傷的程度也不斷加大，當疊氮化鈉濃度為 0.8 mmol/L、時間為8 h時，苦蕎麥種子發芽率為49%，相對發芽率為51.04%，因此得出疊氮化鈉最適宜的誘變組合為濃度0.8 mmol/L、時間8 h。

2.2 疊氮化鈉處理對苦蕎麥幼苗生理指標的影響

2.2.1 不同濃度疊氮化鈉處理下苦蕎麥葉片MDA含量的變化 對MDA含量的測定結果如圖1所示，可以得出，對照MDA含量為0.667 μmol/L，而疊氮化鈉濃度為 1.5 mmol/L時，MDA含量為1.654 μmol/L，是對照的 2.48倍。相比于對照，處理組的MDA含量總體都在升高，除0.2 mmol/L疊氮化鈉濃度時與對照差異不顯著，其余各組均與對照有顯著差異（P<0.05），隨著處理濃度的增大，各相鄰濃度梯度之間并無顯著差異，說明MDA含量隨處理濃度的增大而增加，但各組之間增加量不多，總體趨勢較為平緩，但相比于對照，MDA含量增加的量越來越大，趨勢也越來越明顯。

2.2.2 不同濃度的疊氮化鈉處理下苦蕎麥葉片SOD活性的變化 由圖2可以看出，對照的SOD活性為48.28 U/g，隨著處理濃度的升高，苦蕎麥葉片中SOD活性也隨之升高，在疊氮化鈉濃度為0.6 mmol/L時，SOD活性為131.84 U/g，達到最大值，而后隨著處理濃度的繼續增大，SOD活性則慢慢減弱，在疊氮化鈉濃度為1.5 mmol/L時，SOD活性下降到6543 U/g。因此可知，疊氮化鈉在低濃度時苦蕎麥葉片SOD活性升高，高濃度時苦蕎麥葉片SOD活性下降，在濃度為04、0.6、0.8 mmol/L時相較于對照差異極顯著（P<0.01）。

2.2.3 不同濃度的疊氮化鈉處理下苦蕎麥葉片POD活性的變化 如圖3所示，POD活性變化與SOD活性變化趨勢相一致，對照POD活性為19.61 U/g，而在疊氮化鈉處理濃度為 0.8 mmol/L 時POD活性為76.92 U/g，達最大值，隨后POD活性逐漸降低，在疊氮化鈉濃度為1.5 mmol/L時POD活性下降為29.93 U/g。由此可知，疊氮化鈉在低濃度時苦蕎麥葉片POD活性上升，高濃度時苦蕎麥葉片POD活性下降，在濃度為 0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L時與對照差異極顯著（P<0.01）。

3 結論與討論

3.1 疊氮化鈉對苦蕎麥種子發芽的最佳誘變濃度和時間

關于疊氮化鈉對種子發芽的影響，國內外學者不斷進行了研究。目前，作為一種常見的誘變劑，很多資料顯示，疊氮化鈉對作物有很高的誘變潛力，其應用于大麥、水稻、蠶豆、高粱等作物并且得到了范圍相當廣泛的突變譜以及相當高的突變頻率[17]。本試驗中以晉蕎2號為試驗材料，探究疊氮化鈉處理對苦蕎麥種子發芽的影響，與疊氮化鈉對一些不同種屬作物研究的結果相比，其最佳誘變濃度和誘變時間都有一定的差異。楊國志等對西瓜的誘變育種研究認為，疊氮化鈉濃度為1.5 mmol/L、誘變時間為1.5 h時，誘變效果最佳[18];陸兆新等對水稻種子誘變的研究表明，疊氮化鈉濃度為 1 mmol/L、誘變時間為12 h時，其誘變效應最為明顯[19];張會靈等對辣椒種子的誘變研究表明，疊氮化鈉濃度為 4 mmol/L、誘變時間為4 h時效果最佳[20]。而疊氮化鈉作用于蓼科植物的研究還比較少，在蓼科植物的誘變育種研究中，有關于誘變劑EMS（甲基磺酸乙酯）對頭花蓼的研究，結果表明，在EMS濃度為 0.6%、誘變時間為24 h或者EMS濃度為0.8%、誘變時間為12 h時，達到半致死條件[21]。本試驗對苦蕎麥的研究結果表明，隨著誘變劑濃度的升高，苦蕎麥種子的發芽率、相對發芽率均有所降低，發芽時間有所延長，在疊氮化鈉濃度為 0.8 mmol/L、誘變時間為8 h時為最佳的誘變組合，在此濃度下，種子發芽率達到49%，相對發芽率為5104%，因此認為疊氮化鈉濃度為0.8 mmol/L時是苦蕎麥種子誘變的半致死濃度，最佳誘變時間為8 h。

3.2 疊氮化鈉對苦蕎麥幼苗MDA含量和SOD、POD活性影響的分析

疊氮化鈉對種子發芽及幼苗生長的影響與逆境環境對種子的影響很相似，抗氧化酶活性的變化與幼苗在逆境條件下的應對反應也一致，疊氮化鈉濃度過大時，可能直接破壞種子的抗性機制，使幼苗體內抗氧化酶活性發生變化[22]。植物器官在逆境中，由于自由基對其造成的損害而會使植物器官發生膜脂的過氧化作用，生物膜中的不飽和脂肪酸分解后能產生MDA，可以和蛋白質結合，使膜中的結構蛋白和酶進行聚合、交聯，形成不可溶的化合物（脂褐素）沉積，因此能夠對質膜系統造成進一步的傷害[23]。通過MDA含量的測定結果可以得出，相比于對照，處理組的MDA含量總體都是在升高的，而且隨著處理濃度的增大，MDA含量上升的量越來越多，趨勢越來越明顯，這就表明脂膜受到了損傷，而且誘變劑濃度越高，其受到的損傷越大。植物抗氧化系統中的重要酶類包括SOD、POD，在正常的條件下，這些酶能夠有效地將體內的活性氧自由基清除掉，以保護細胞免受傷害，但是在逆境條件下，植物清除活性氧的能力低于植物體內活性氧自由基的產生速度，因此會引起傷害[23]。而植物體內的抗氧化酶類如SOD、POD、過氧化氫酶（CAT）等可有效清除氧自由基，在對SOD、POD活性的測定中明顯看出，在低濃度時，SOD、POD含量升高，高濃度時，含量均有所下降，說明長時間、高濃度的疊氮化鈉誘變使苦蕎麥抗氧化系統受到抑制，SOD、POD的活性受到損傷，而低濃度疊氮化鈉誘變使植物體內抗氧化系統被激活，因此呈現出上升趨勢，在疊氮化鈉濃度為0.6 mmol/L時SOD活性達到最大值，在疊氮化鈉濃度為0.8 mmol/L時POD活性達到最大值。

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