內(nèi)生細(xì)菌B69定殖能力及其對人參根腐病防效研究

林星辰 田義新 王澤 牛林飛

摘要：研究人參內(nèi)生菌B69菌株在人參根、莖、葉及其根際土壤中的定殖規(guī)律，以及B69菌株對人參根腐病的防效，以期為新型人參根腐病生防制劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。采用抗生素標(biāo)記法，篩選出最佳標(biāo)記菌株;采用盆栽和田間試驗(yàn)測定自然土與無菌土處理下B69菌株在人參植株內(nèi)和根際土壤中的定殖能力。結(jié)果表明，標(biāo)記菌株與未標(biāo)記菌株在形態(tài)特征、拮抗能力、防病效果等方面無顯著差異;B69菌株能夠高效定殖在人參根部;B69菌株對人參根腐病有較好的防治效果，田間試驗(yàn)結(jié)果表明該菌處理后的病情指數(shù)為25.41，對根腐病的相對防效為58.56%。說明B69菌株是有防治人參根腐病潛力的生防菌。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生細(xì)菌;B69菌株;定殖能力;人參根腐病;生物防治;生防制劑開發(fā)應(yīng)用

中圖分類號： S432.1? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）10-0135-03

隨著植病防治策略的改變以及公眾對環(huán)境與健康問題的日益關(guān)注，生物殺菌劑的地位越來越重要[1-2]，但是進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化的品種很少，主要原因是生物殺菌劑的作用范圍一般比較窄等。微生物制劑的缺陷已經(jīng)受到研究人員的重視，并且致力于多功能微生物制劑的研究[3]。人參根腐病主要侵染人參的根部，造成根部軟化腐爛，植株萎蔫死亡[4]。人參根腐病致使人參產(chǎn)量、質(zhì)量大幅度下降，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。隨著人們對無公害食品的需求的日益增加以及對環(huán)境保護(hù)的日益關(guān)注，生物防治成為了人們控制植物病害的理想途徑[5-6]。因此，篩選出生物活性高、抗菌譜廣的菌株具有重要的意義。目前國內(nèi)外對番茄[7]、大蒜[8]、黃瓜[9]等植物生物防治的研究已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展，但對人參病害的生物防治還罕有報(bào)道。本研究從人參的根際土壤中篩選出1株對人參根腐病病原菌有極強(qiáng)拮抗作用的菌株B69，研究該菌株在人參的根、莖、葉和土壤的定殖規(guī)律及其對根腐病的盆栽和田間防治效果，以期為開發(fā)出具有應(yīng)用價(jià)值的生防菌劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 內(nèi)生細(xì)菌B69菌株由課題組從人參根中分離得到，經(jīng)鑒定為死谷芽孢桿菌（Bacillus vallismortis），保存在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物栽培研究室。人參根腐病病原菌[Fusarium solani（Mart.） App. et Wollenw]，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物研究中心提供。

1.1.2 供試植株 人參根腐病防效試驗(yàn)所用的人參植株采自吉林省白山市撫松縣萬良鎮(zhèn)，5年生。

1.1.3 供試培養(yǎng)基及其他試劑 供試細(xì)菌的保存和培養(yǎng)使用營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基;供試細(xì)菌液體發(fā)酵培養(yǎng)使用營養(yǎng)肉湯（NB）基礎(chǔ)培養(yǎng)基;病原真菌使用馬鈴薯葡萄糖（PDA）固體培養(yǎng)基;此外還使用了PDA液體培養(yǎng)基。試劑主要有 10 mg/mL 利福平（Rif）溶液（95%乙醇溶解），羧甲基纖維素鈉（CMC），10%多菌靈可濕性粉劑，均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物栽培研究室提供。

1.1.4 試驗(yàn)場地 人參田間試驗(yàn)于2017年6—9月在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物科技示范園進(jìn)行，采用一面坡式蔭棚遮蔭種植。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 抗利福平突變菌株的篩選 將活化好的拮抗細(xì)菌在32 ℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)2 d制成拮抗細(xì)菌種子液。取 10 mL 種子液接種在含 20 μg/mL Rif的NB培養(yǎng)液中。在 30 ℃、180 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)4～5 d后，如果培養(yǎng)液變渾濁，則吸取10 mL接入Rif濃度為40 μg/mL的100 mL NB培養(yǎng)基中，以后每次培養(yǎng)液中Rif的濃度依次增加，直至標(biāo)記至300 μg/mL，Rif的濃度分別為40、60、80、100、150、200、300 μg/mL。然后用含300 μg/mL Rif的NB培養(yǎng)基平板檢測并挑取能穩(wěn)定生長，且拮抗活性、菌落形態(tài)變化不大的標(biāo)記菌株。為檢測其遺傳穩(wěn)定性，將其在NB培養(yǎng)基（不含Rif）中連續(xù)培養(yǎng)10代后涂布于含300 μg/mL Rif的NB培養(yǎng)基平板上，觀察是否能正常生長。為檢測其拮抗穩(wěn)定性，采用平板擴(kuò)散法[10]，以原始菌株為對照，觀察抑菌率是否存在差異。

1.2.2 抗利福平標(biāo)記菌株在人參土壤中的定殖 采用灌根接種法[11]，每盆3株，于第1天、第3天、第5天、第7天、第10天、第15天、第20天、第30天分離根際土壤的細(xì)菌，在含有 300 μg/mL 的利福平NA培養(yǎng)基平板中均勻涂布稀釋液，3 d 后計(jì)數(shù)，計(jì)算含菌量。

1.2.3 細(xì)菌在植株內(nèi)的定殖 采用灌根接種法[11]，用盆缽種植方式，分別于接菌后第7天、第10天、第15天、第20天、第30天時(shí)隨機(jī)取2株人參苗進(jìn)行根部、莖、葉目標(biāo)菌株的分離、回收。

1.2.4 內(nèi)生菌株B69對人參根腐病防效的盆栽試驗(yàn) 盆栽試驗(yàn)采用保護(hù)法和治療法，待人參展葉期時(shí)，采用灌根接種法接種B69菌株發(fā)酵菌液和根腐病病菌孢子懸浮液。保護(hù)法：先接種B69菌株發(fā)酵菌液，3 d后再接種3×104個(gè)/mL根腐病病菌孢子懸浮液;治療法：先接種3×104個(gè)/mL根腐病病菌孢子懸浮液，3 d后再接種B69菌株發(fā)酵菌液;以接種無菌發(fā)酵液為對照。每個(gè)處理5盆，每盆3株人參苗，20 d灌根1次，每株接種B69菌株發(fā)酵菌液的濃度為108 CFU/mL，接種量為 50 mL，共灌根5次。處理完成20 d后隨機(jī)取5株人參苗觀察根腐病發(fā)病情況，病情指數(shù)分級方法參考馬鳳茹等的方法[12]。

1.2.5 內(nèi)生菌株B69對人參田間病害的防治效果 田間試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，共設(shè)置4個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積為3.0 m2。處理1：單接病原菌;處理2：生防菌+病原菌;處理3：10%多菌靈可濕性粉劑+病原菌;處理4：未進(jìn)行處理（CK）。待人參苗完全展葉后開始處理，處理1每個(gè)小區(qū)每株澆灌50 mL病原菌液;處理2每個(gè)小區(qū)每株澆灌 50 mL 根腐病病菌液+50 mL B69菌株發(fā)酵菌液;處理3和4每個(gè)小區(qū)噴施4 g/m2藥液或清水。每隔20 d處理1次，共處理5次。

人參田間試驗(yàn)每個(gè)處理分別在7月5日、8月8日、9月10日調(diào)查3次，每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選擇5點(diǎn)，每點(diǎn)調(diào)查10株，記錄總?cè)~片數(shù)和各葉片發(fā)病級數(shù)，計(jì)算出各處理的病情指數(shù)和防治效果。病害嚴(yán)重度分級，即人參根腐病發(fā)病程度參考馬鳳茹等的方法[12]進(jìn)行分級計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗利福平突變菌株的篩選

通過對B69菌株進(jìn)行抗利福平篩選，得到能在含利福平的NA固體培養(yǎng)基上穩(wěn)定生長，且菌落形態(tài)、顏色等與原始菌株相同的突變菌株（圖1、圖2）;在不含利福平的NB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)后，其培養(yǎng)液對根腐病菌仍具有抑制作用，且與原始菌株的抑制效果基本相同。

2.2 抗利福平突變菌株的遺傳穩(wěn)定性

挑取抗利福平的突變標(biāo)記菌株，在不含利福平的NB液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)10代后，仍能在含利福平的NA固體培養(yǎng)基上生長（圖3、圖4），表明這株生防菌株的突變菌株具有遺傳穩(wěn)定性，可用于定殖研究。

2.3 內(nèi)生菌B69菌株在人參植株內(nèi)及其根際土壤中的定殖動(dòng)態(tài)

2.3.1 內(nèi)生菌B69菌株在根際土壤中的定殖動(dòng)態(tài) 由圖5可知，B69菌株具有較好的土壤定殖能力。隨著時(shí)間的延長，其在自然土和滅菌土中定殖量的消長動(dòng)態(tài)一致，均呈現(xiàn)先降后升再降的趨勢。B69菌株在滅菌土中的定殖量小于在自然土中的定殖量，在滅菌土中的定殖量變化幅度則大于在自然土中的定殖量變化幅度。分析其原因可能是因?yàn)橥寥罍缇笃淅砘再|(zhì)、土壤微生態(tài)結(jié)構(gòu)遭到破壞，且沒有其他微生物對所接入生防細(xì)菌的影響，從而可能相對不利于生防細(xì)菌定殖能力的發(fā)揮。B69菌株在土壤中定殖的初始菌量為1×107 CFU/g，第3天后在滅菌土和自然土中定殖量迅速下降，第10天定殖量達(dá)到1個(gè)峰值，在自然土和滅菌土中分別為6.57×106、4.25×106 CFU/g;第10天以后隨著處理時(shí)間的延長定殖量逐漸減少，但在第30天B69菌株在自然土和滅菌土中的定殖量仍可達(dá)到105 CFU/g以上。

2.3.2 內(nèi)生菌B69菌株在人參植株內(nèi)的定殖動(dòng)態(tài) 人參定苗的進(jìn)行標(biāo)記菌株發(fā)酵液灌根，第3天開始定期檢測標(biāo)記菌株在人參根、莖、葉中的定殖數(shù)量，發(fā)現(xiàn)植株的根中可檢測到菌株，但對照中無。從定殖數(shù)量上看，B69菌株在人參植株的根內(nèi)定殖數(shù)量最大，莖中次之，葉中最少（圖6，圖7）;隨著定殖時(shí)間的延長，各部分定殖菌量呈現(xiàn)先增后減的趨勢，這說明細(xì)菌進(jìn)入植物體內(nèi)的途徑可能與根部有關(guān)。B69菌株在人參體內(nèi)表現(xiàn)出一定的定殖能力，從不同處理來看，自然土中菌株在人參體內(nèi)的傳導(dǎo)能力優(yōu)于滅菌土，且自然土中的定殖菌量高于滅菌土，因此推斷自然土中存在的某些微生物可能有利于B69菌株的定殖。自然土中生防菌株B69在人參根、莖、葉內(nèi)的最大定殖量均出現(xiàn)在第15天，分別為3.54×106、5.26×105、2.12×105 CFU/g;滅菌土中生防菌株B69在人參根、莖、葉內(nèi)的最大定殖量也出現(xiàn)在第15天，分別為2.11×106、

2.62×105、5.83×104 CFU/g。

2.4 內(nèi)生菌B69發(fā)酵液對人參根腐病的盆栽防效

由表1可以看出，內(nèi)生菌B69菌株發(fā)酵液對根腐病的防治效果明顯。采用保護(hù)作用處理的防效優(yōu)于治療作用處理的防效，兩者的防效分別達(dá)到60.8%、56.6%，表明菌株B69發(fā)酵液的預(yù)防作用效果較好，但兩者防效差異不顯著。保護(hù)作用處理和治療作用處理的病情指數(shù)分別為25.32、28.11，均低于對照處理的47.83，差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）。

2.5 內(nèi)生菌B69對人參根腐病的田間防效

由表2可以看出，在不接種病原菌的CK中，根腐病發(fā)病的病情指數(shù)為41.58，CK組的病情指數(shù)可達(dá)單接根腐病病菌組的67%左右。結(jié)果表明，5年生人參苗本身已經(jīng)存在發(fā)病機(jī)制，若不接種根腐病病菌，供試人參苗亦可發(fā)病。在單接根腐病病菌對照中，病情指數(shù)為61.34;在內(nèi)生菌B69菌株與根腐病病菌混接處理中，病情指數(shù)為25.41，其對根腐病的相對防效為58.56%;而在10%多菌靈可濕性粉劑與根腐病病菌混接處理中，病情指數(shù)為28.14，其對根腐病的相對防效為54.12%。可見，生防菌B69菌株對人參根腐病具有更好的防治效果，且其相對防效顯著高于農(nóng)藥處理組（P<0.05）。

3 結(jié)論與討論

研究表明，定殖是生防菌發(fā)揮作用的重要因素，許多室內(nèi)防治效果顯著的菌株在田間很難達(dá)到預(yù)期的效果，究其原因是不能有效定殖于植物根際或體內(nèi)[13]。本研究采用抗生素標(biāo)記法，篩選出最佳標(biāo)記菌株。定殖動(dòng)態(tài)結(jié)果表明，B69菌株在人參根際可有效定殖30 d以上，覆蓋人參的整個(gè)旺盛生長期，表明B69菌株在生產(chǎn)實(shí)踐上具有較大的生物防治潛力。

細(xì)菌作為生防菌防治植物病害主要是利用其強(qiáng)力的競爭機(jī)制，其中芽孢桿屬（Bacillus spp.）由于具有抗逆性強(qiáng)、繁殖速度快、易于培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用作生防菌源[14]。Dionisio利用B. amyloliquefaciens DGA14防治香蕉的冠腐病取得了較好的效果[15];Chen等利用B. amyloliquefaciens S20控制茄子的細(xì)菌性枯萎病效果顯著[16];賈斌等利用解淀粉芽孢桿菌拮抗人參黑斑病病菌，抑制率達(dá)到80%[17]。本研究結(jié)果表明，死谷芽孢桿菌B69菌株對根腐病病菌抑制效果明顯。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，采用保護(hù)作用處理的防效優(yōu)于治療作用處理的防效，兩者的防效分別達(dá)到60.8%、56.6%，表明B69菌株發(fā)酵液的預(yù)防作用效果較好。保護(hù)和治療作用處理的病情指數(shù)分別為25.32、28.11，均顯著低于對照組的47.83（P<0.05）。田間試驗(yàn)結(jié)果表明，人參在栽植后單接根腐病病菌的病情指數(shù)為61.34;在生防菌與根腐病病菌混接處理中，人參在栽植后的病情指數(shù)為25.41，其對人參根腐病的相對防效為 58.56%;而在10%多菌靈可濕性粉劑與根腐病病菌混接處理中，人參在栽植后的病情指數(shù)為28.14，其對人參根腐病的相對防效為 54.12%，可見，B69菌株對人參根腐病具有更好的防治效果，且其相對防效較農(nóng)藥組高4.44%。因此驗(yàn)證了B69菌株是防治根腐病的良好菌源，具有較大的開發(fā)潛能。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳彩燕，郭 剛. 生物殺菌劑研發(fā)進(jìn)展[J]. 熱帶林業(yè)，2002，30（3）：16-18，21.

[2]趙繼紅，李建中. 農(nóng)用微生物殺菌劑研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)藥，2003，42（5）：6-8.

[3]馮 蕾，王志方，張小勇，等. 微生物復(fù)合肥對主要農(nóng)作物增產(chǎn)效果研究[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，1997（1）：24-26.

[4]王芝恩，周 強(qiáng)，張麗杰，等. 遼寧東部地區(qū)林下人參幾種常見病害[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009（10）：112-114.

[5]Ryu H，Park H，Suh D S，et al. Biological control of Colletotrichum panacicola on Panax ginseng by Bacillus subtilis HK-CSM-1[J]. Journal of Ginseng Research，2014，38（3）：215-219.

[6]Jiang C M，Shi J L，Liu Y L，et al. Inhibition of Aspergillus carbonarius and fungal contamination in table grapes using Bacillus subtilis[J]. Food Control，2014，35（1）：41-48.

[7]馮志珍，李金嶺，陳太春，等. 番茄疫霉根腐病拮抗細(xì)菌FC12-05的篩選、鑒定及其抑菌活性初探[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，40（4）：107-114.

[8]鄧振山，馬娜娜，徐文梅，等. 大蒜鱗莖中抗番茄灰霉病內(nèi)生菌的篩選及其防治效果[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，40（5）：50-56.

[9]韋巧婕，鄭新艷，鄧開英，等. 黃瓜枯萎病拮抗菌的篩選鑒定及其生物防效[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，36（1）：40-46.

[10]賈鳳安，陳 亮，陳 立，等. 大棚甜瓜三種主要真菌病害拮抗細(xì)菌的篩選與鑒定[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2010，37（6）：505-510.

[11]孫 卓. 人參病害生防細(xì)菌的篩選及其防病作用研究[D]. 長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[12]馬鳳茹，邢云章，王韻秋. 人參銹腐病調(diào)查方法初探[J]. 中藥材，1983（5）：12-15.

[13]Weyens N，Lelie D V D，Taghavi S，et al. Phytoremediation：plant-endophyte partnerships take the challenge[J]. Current Opinion in Biotechnology，2009，20（2）：248-254.

[14]權(quán)春善，王軍華，徐洪濤，等. 一株抗真菌解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定及其發(fā)酵條件的初步研究[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2006，46（1）：7-12.

[15]Alvindia D G. Enhancing the bioefficacy of Bacillus amyloliquefaciens DGA14 with inorganic salts for the control of banana crown rot[J]. Crop Protection，2013，51：1-6.

[16]Chen D，Liu X，Li C，et al. Isolation of Bacillus amyloliquefaciens S20 and its application in control of eggplant bacterial wilt[J]. Journal of Environmental Management，2014，137（1）：120-127.

[17]賈 斌，趙貞麗，沈國娟，等. 人參黑斑病生防用內(nèi)生拮抗菌分離鑒定及發(fā)酵濃縮液的性質(zhì)[J]. 中國森林病蟲，2014，33（3）：5-10，17.