北柴胡轉錄因子BcAP2-13的原核表達和多克隆抗體制備

徐嬌 朱楚然 都明理 王麗紅 隋春 魏建和

摘要：利用帶有促溶標簽SUMO和純化標簽6×His的原核表達載體，構建了調控北柴胡皂苷生物合成的轉錄因子基因BcAP2-13的原核表達載體p13-SUMO-His6。載體熱激轉化大腸桿菌感受態細胞BL21（DE3）后，用異丙 基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）誘導培養，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析表明，28 ℃和37 ℃不同溫度誘導條件下均得到了融合蛋白13-SUMO-His 6。以Ni-NTA柱純化的融合蛋白為抗原，免疫成年兔4次以制備多克隆抗體。間接酶聯免疫法檢測結果表明，所得抗體效價較高。提取北柴胡毛狀根及BcAP2-13超表達毛狀根的總蛋白，免疫印跡檢測結果表明，在2種毛狀根蛋白樣品中均能檢測到與預計13-SUMO-His6蛋白分子量大小一致的條帶，BcAP2-13過表達毛狀根總蛋白樣品的條帶強于普通毛狀根總蛋白樣品的條帶，與預期一致。成功制備了北柴胡BcAP2-13的多克隆抗體，為進一步研究北柴胡轉錄因子BcAP2-13的確切作用位點和調控機制奠定了基礎。

關鍵詞：北柴胡;轉錄因子;原核表達;多克隆抗體制備;免疫印跡

中圖分類號： S188;S567.7+90.1? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）10-0066-03

1994年Jofuku等首次發現了AP2/ERF轉錄因子在模式植物擬南芥[Arabidopsis thaliana （L.）Heynh]中調控花發育[1]。AP2/ERF是植物特有的一類轉錄因子，含有由60～70個氨基酸組成的AP2/ERF結構域[2]。AP2/ERF類轉錄因子參與水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）、乙烯、脫落酸（ABA）等多種信號轉導途徑[3-5]，已證實其中多個轉錄因子調控重要藥用植物的藥效成分合成。如在轉基因長春花中過表達 ORCA3-G10H提高了長春質堿、阿瑪堿的含量，降低了脫水長春堿和長春堿含量[6]。黃花蒿中的一個AP2轉錄因子TAR1在調控腺毛形態、表皮蠟質組成和青蒿素含量中起至關重要的作用。抑制TAR1基因表達降低青蒿素含量，基因過表達則增加青蒿素含量[7]。筆者所在課題組前期克隆到了1個AP2/ERF類轉錄因子基因BcAP2-13，間接試驗證實了這個轉錄因子調控柴胡皂苷生物合成，為直接證實其調控作用，找到其直接作用的基因靶點，Chip免疫共沉淀是重要方法之一，利用這一方法有必要先獲得BcAP2-13的特異抗體。蛋白特異抗體在蛋白功能的研究中發揮著重要的作用，為基因編碼蛋白功能的研究提供必要條件[8-9]。本研究利用大腸桿菌原核表達獲得了BcAP2-13的融合蛋白，Ni-NTA親和柱純化后作為免疫原，制備了BcAP2-13的多克隆抗體。間接酶聯免疫（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定了抗體的效價，Western-blot印跡檢測了抗體的特異性，為進一步深入開展BcAP2-13基因功能的研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物、細菌和載體 北柴胡毛狀根為筆者所在課題組前期由發根農桿菌誘導北柴胡無菌苗獲得，北柴胡BcAP2-13超表達毛狀根是由含有BcAP2-13基因的發根農桿菌誘導獲得。大腸桿菌TOP10菌株、大腸桿菌BL21（DE3）菌株和原核表達載體pET-28a-sumo購自武漢戴安生物科技有限公司。

1.1.2 試劑 高保真DNA聚合酶（PrimeSTARHS DNAPolymerase）購于寶日醫生物技術（北京）有限公司;BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ內切酶、T4 DNA連接酶購于NEB公司;DNA純化回收試劑盒（Universal DNAPurification Kit）、質粒小提試劑盒（TIANprep Mini PlasmidKit）購于天根生化科技（北京）有限公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、弗氏完全佐劑（Freunds adjuvantcomplete）和弗氏不完全佐劑（Freunds adjuvant incomplete）購于Sigma公司;0.45 μm硝酸纖維素膜（Nitro Cellulose）購于GE Healthcare Life Science;辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，簡稱IgG）購于北京康為世紀生物科技有限公司;尿素購于Amresco公司;ECL工作液（Detection reagent 1，Detection reagent 2）購于BioRad公司。SDS-PAGE預制膠購于武漢金斯瑞公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原核表達載體構建 根據BcAP2-13基因序列，設計基因擴增正向序列PL040F：5′-CGCGGATCCATGATGCAATCAAATTTTG-3′和反向序列L040R：5′-GACGTCGACTCAAACAATTAAAAAAG-3′（劃線部分為酶切位點）。以BcAP2-13-PDOR221重組載體質粒為模板進行PCR擴增，PCR條件為94 ℃ 5 min;98 ℃ 10 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，35個循環;72 ℃ 10 min。回收PCR產物，BamH Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切后與同樣雙酶切后的pET-28a-sumo載體相連，得到重組質粒 p13-SUMO-His6，而后轉入大腸桿菌感受態DH5α，通過測序驗證重組載體中基因序列的正確性。

1.2.2 重組表達載體p13-SUMO-His6在大腸桿菌中的表達 （1）小樣表達：提取質粒p13-SUMO-His6，轉入大腸桿菌感受態細胞BL21（DE3），挑選轉化平板的6個單克隆，分別接種3 mL卡那抗性液體培養基，37 ℃，220 r/min搖培至D600 nm值為0.5～0.6，加入IPTG終濃度為0.5 mmol/L，20 ℃誘導表達3.5 h。離心收集菌體，移除上清液，按10 mL PBS/g 菌體的量重懸菌體;利用超聲破碎儀進行菌體細胞破碎，SDS-PAGE檢測表達情況。結果顯示蛋白質在上清和包涵體中均有表達，且上清中的量滿足繼續進行大量表達純化。