江蘇省畜禽飼料中轉基因成分的檢測分析

邢宇俊 陸丹丹 吳季榮 王園園 徐劍宏 史建榮

摘要：隨著轉基因植物研究的迅速發展，轉基因農產品的應用也更加廣泛。在我國，轉基因農產品的來源主要是進口，主要是玉米、大豆，主要用于飼料加工行業。為了調查轉基因玉米、大豆在江蘇省畜禽飼料市場的分布情況，在江蘇省市場抽取40份雞、鵝和豬飼料以及飼料原料，通過定性PCR檢測玉米內標zSSIIb、大豆內標Lectin、花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子、NOS終止子、Bt、EPSPS基因，同時檢測玉米、大豆轉化體事件MON810、MON89788、GTS40-3-2和MON87701。結果表明，90%的飼料都含有轉基因成分;轉基因玉米轉化體事件MON810占50%，轉基因大豆轉化體MON89788、GTS40-3-2、MON87701的檢出率都為80%。由研究結果可知，江蘇省市場的雞、鵝和豬飼料及飼料原料中轉基因成分的占有率較高，需要進一步加強對飼料原料的轉基因監管。

關鍵詞：畜禽飼料;轉基因作物;轉基因成分檢測

中圖分類號： S816.17? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）10-0052-04

轉基因生物（genetically modified organisms，簡稱GMOs）是指借助于基因工程技術將其他來源的基因轉移到植物、動物或微生物的基因組中，使其性狀發生改變，如提高抗蟲性、營養成分含量或提升耐除草劑性狀等，以期達到延長保質期等目的[1-2]。

自從首例轉基因產品被批準商業化生產以來，越來越多的轉基因作物在不同國家和地區開始被商業化種植，截至2016年，全球種植轉基因作物的面積已達到1.85億hm2。其中種植面積排名前4位是大豆、玉米、棉花、油菜，分別占全球轉基因作物種植面積的50%、33%，12%、5%[3]。在我國允許進口的46種轉基因農產品中，轉基因大豆、玉米的品種最多，它們主要被用于飼料加工業中[4-5]。

我國對于飼料糧的需求缺口非常大，在全球糧食危機的背景下，我們不能單純地使用非轉基因糧食作為飼料加工原料，而應將非轉基因作物用于滿足飼料工業。由于江蘇省的畜禽養殖業比較發達，對飼料原料的需求量較大，因此，可以帶來高附加值的轉基因作物成為飼料生產的首要選擇。

對大豆、玉米開展轉基因檢測，通常檢測的外源基因包括大多數轉基因產品中使用的花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子、胭脂堿合成酶NOS終止子、抗蟲Bt基因和除草劑EPSPS基因。由于這些序列在大多數轉基因產品中存在一種或多種，因此本研究擬選用常規的核酸檢測技術PCR方法進行分析[4，6]，同時對陽性樣品進行轉化體品系的確定。通過對江蘇省飼料中轉基因成分的篩查，可為政府部門對飼料業的轉基因監管提供數據，也可為江蘇省轉基因行業的監管提供支撐。

1 材料與方法

1.1 飼料樣品

共選取40份飼料，分別由多家公司生產，具體飼料信息見表1。其中包括乳豬濃縮飼料、母豬濃縮飼料、草雞配合飼料、種雞配合飼料、鵝飼料等，以及用作飼料原料的麥麩、玉米和豆粕。

1.2 主要試劑

Taq DNA聚合酶、DNA marker、dNTPs，購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司;引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。其他試劑為實驗室常規分析純試劑。

1.3 方法

1.3.1 PCR引物 根據農業部（現為農業農村部）頒布的標準條例，對飼料樣品中含有的內參基因Lectin和zSSIIb，外源基因花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子、NOS終止子、EPSPS基因、Bt基因以及GTS40-3-2、MON89788、MON87701、MON810轉化體特異性序列進行檢測。引物序列相關信息見表2。

1.3.2 飼料DNA的提取 稱取10 g飼料樣品（顆粒性的），在攪拌器中磨碎（顆粒大小應小于2 mm。用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取DNA[14]。

1.3.3 PCR檢測分析 PCR體系：2.5 μL 10×PCR buffer，2.5 μL Mg2+，2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），2 μL DNA模板，0.25 μL Taq DNA聚合酶，加水補至25 μL。

Lectin、zSSIIb、 CaMV35S啟動子、NOS終止子、Bt、GTS40-3-2、MON89788、MON810、MON87701基因片段的PCR反應條件：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環;72 ℃，7 min。EPSPS基因的PCR反應條件：94 ℃ 7 min;94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，5個循環;94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環;72 ℃ 7 min。PCR產物用2%瓊脂糖檢測，通過凝膠成像系統觀察基因擴增片段的大小。

2 結果與分析

2.1 飼料中DNA的質量分析

對提取的飼料DNA進行質量和濃度的測定，用核酸蛋白濃度檢測儀測定所有樣品溶液的濃度，并稀釋至40 ng/μL后使用，純度（D260 nm/280 nm）均在1.7～2.0間，表明提取的DNA濃度和純度較好，可用于下一步試驗。

2.2 定性PCR結果分析

2.2.1 飼料中內參基因的分析 當前飼料的主要來源是玉米和豆粕，通過對飼料中內參基因的分析可以判斷飼料的組成部分。通過對40種飼料樣品的內參基因Lectin和zSSIIb進行分析發現，混合飼料主要來源于玉米、大豆（本試驗也對水稻SPS、油菜HMGI/Y內參基因進行擴增，沒有擴增出相應片斷）;從豆粕、玉米飼料中分別擴增出對應的內參基因;從麥麩中檢測出大豆內參基因（圖1）。

2.2.2 飼料中外源基因的篩查 對玉米和大豆及其加工品中的外源基因進行檢測，通過對其所有轉基因轉化體的分析發現，幾乎所有的轉基因玉米和大豆中含有CaMV35S啟動子、NOS終止子、Bt、EPSPS中的1種或幾種基因，因此對40份飼料樣品中外源基因的篩查選用CaMV35S啟動子、NOS終止子、Bt、EPSPS基因進行。圖2結果顯示，在混合飼料中，36份含有CaMV35S啟動子，占總飼料的90%;32份飼料含有NOS終止子，占總飼料的80%;32份飼料含有Bt基因，占總飼料的80%;32份飼料含有EPSPS基因，占總飼料的80%。由此可見，飼料中轉基因成分的占比較高。

2.2.3 飼料中所含轉基因轉化體的驗證 根據我國農業部（現為農業農村部）批準進口的轉基因轉化體品種以及對其外源基因的分析，對其中的轉化體品系（轉基因玉米MON810與轉基因大豆MON89788、GTS40-3-2、MON87701）進行轉化體特異性序列擴增比對。由圖3可以看出，有20份飼料中含有轉基因玉米MON810，占總飼料的50%;32份飼料中都含有轉基因大豆MON98788、GTS40-3-2、MON87701，占總飼料的80%。

2.3 40份飼料中轉基因成分的分布

由圖4對每份樣品的分析結果可以看出，擴增檢測出大豆Lectin、玉米zSSIIb內參基因的飼料樣品，都含有1種或多種外源基因成分;共檢測到36份含有轉基因成分的飼料，占總數的90%（36/40）;而沒有檢測出大豆Lectin、玉米zSSIIb內參基因也沒有檢測到其體他外源基因成分的樣品占10%。CaMV35S啟動子的檢出率為90%（36/40）;NOS終止子的檢出率為80%（32/40）;Bt基因的檢出率為80%（32/40）;EPSPS基因的檢出率為80%（32/40）;轉基因玉米轉化體事件MON810的檢出率為50%（20/40）;轉基因大豆MON89788、MON87701、GTS40-3-2的檢出率都為80%（32/40）。可見40份飼料樣品中轉基因飼料的比例較高。

3 討論

當前種植面積比較大的轉基因農作物是玉米、大豆，在我國國內，轉基因玉米、大豆的很多轉化體已經被批準進口用于飼料加工。在本試驗中發現，用于飼料中的麥麩沒有檢測出任何轉基因成分，這是因為轉基因小麥商業化生產的比較少，并且國內也不允許轉基因小麥進口;另外，24號5%乳豬復合預混料和28號5%產蛋期復合預混料中也不含有任何轉基因成分。此外，36份飼料和飼料原料中都含有轉基因成分，占比達到90%，可見江蘇省畜禽飼料中轉基因產品的占有率比較高，江蘇省飼料中轉基因成分的含量同山西省的情況比較接近，山西省達到了100%[15]，這也說明我國飼料業中轉基因產品的占有率很高，檢測出的轉基因轉化體事件是我國批準進口的轉基因材料，允許用于飼料加工業。

在本試驗中發現，用于飼料原料的玉米顆粒是轉基因玉米MON810。而國內轉基因作物及其產品的監管主要集中在大田作物、種子行業、食品行業等領域，對飼料原材料中轉基因材料的監管力度比較小，而江蘇省內飼料中使用轉基因產品作為原材料的飼料比例較高，應該加強對轉基因原材料的跟蹤和監管，以免原材料散落于大田中造成污染，從而保證轉基因農產品的合理、合法使用。

參考文獻：

[1]Greiner R，Konietzny U. Presence of genetically modified maize and soy in food products sold commercially in Brazil from 2000 to 2005[J]. Food Control，2008，19（5）：499-505.

[2]Arun O O，Yilmaz F. PCR detection of genetically modified maize and soya in mildly and highly processed foods[J]. Current Opiuion in Biotechnology，2011，22（S1）：S96.

[3]James C. Global status of commercialized biotech/GM crops：2016. ISAAA Brief No. 52[Z]. Ithaca，NY：ISAAA，2016.

[4]Forte V T，Di Pinto A，Martino C，et al. A general multiplex-PCR assay for the general detection of genetically modified soya and maize[J]. Food Control，2005，16（6）：535-539.

[5]陳 亮，黃慶華，孟麗輝，等. 轉基因作物飼用安全性評價研究進展[J]. 中國農業科學，2015，48（6）：1205-1218.

[6]Miraglia M，Berdal K G，Brera C，et al. Detection and traceability of genetically modified organisms in the food production chain[J]. Food and Chemical Toxicology：an International Journal Published for the British Industrial Biological Research Association，2004，42（7）：1157-1180.

[7]農業部1782號令-3-2012. 轉基因植物及其產品成分檢測調控元件CaMV35S啟動子、FMV35S啟動子、NOS啟動子、NOS終止子和CaMV35S終止子定性PCR方法[S]. 北京：中國標準出版社，2012.

[8]農業部1861號公告-5-2012. 轉基因植物及其產品成分檢測CP4-EPSPS基因定性PCR方法[S]. 北京：中國標準出版社，2012.

[9]農業部953號公告-6-2007. 轉基因植物及其產品成分檢測抗蟲轉Bt基因水稻定性PCR方法[S]. 北京：中國標準出版社，2007.

[10]農業部1861 號公告-2-2012. 轉基因植物及其產品成分檢測耐除草劑大豆GTS 40-3-2及其衍生品種定性PCR方法[S]. 北京：中國標準出版社，2012.

[11]農業部2122號公告-16-2014. 轉基因植物及其產品成分檢測抗蟲玉米MON810及其衍生品種定性PCR方法[S]. 北京：中國標準出版社，2014.

[12]農業部1485號公告-6-2010. 轉基因植物及其產品成分檢測耐除草劑大豆MON89788及其衍生品種定性PCR方法[S]. 北京：中國標準出版社，2010.

[13]農業部2259號公告-7-2015. 轉基因植物及其產品成分檢測抗蟲大豆MON87701及其衍生品種定性PCR方法[S]. 北京：中國標準出版社，2015.

[14]農業部1485號公告-4-2010. 轉基因植物及其產品檢測DNA提取和純化[S]. 北京：中國標準出版社，2010.

[15]袁建琴，趙江河，史宗勇，等. 動物飼料中轉基因抗草甘膦大豆GTS40-3-2成分的檢測[J]. 大豆科學，2016（2）：295-300.