CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻中的發(fā)展和利用

沈明晨 薛超 喬中英 龔志云

摘要：基因組學(xué)的快速發(fā)展和多種基因組編輯技術(shù)的出現(xiàn)，對(duì)植物科學(xué)以及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中的基因功能研究和遺傳改良產(chǎn)生了巨大影響。其中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)能夠快速編輯各種生物體中的基因組，以其簡(jiǎn)單穩(wěn)定高效等優(yōu)點(diǎn)，成為目前最先進(jìn)且被廣泛運(yùn)用的系統(tǒng)。水稻是我國最重要的糧食作物之一，其遺傳資源豐富且基因組小，適合用于基因組編輯技術(shù)的研究。討論水稻改良的基因組編輯策略，重點(diǎn)介紹CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻抗病性、抗逆性、雜種優(yōu)勢(shì)等方面的應(yīng)用和進(jìn)展，強(qiáng)調(diào)CRISPR/Cas9在水稻改良中的主要挑戰(zhàn)和發(fā)展意義。

關(guān)鍵詞：水稻;CRISPR/Cas9;基因組編輯;作物改良

中圖分類號(hào)： S511.01? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）10-0005-06

水稻在不同環(huán)境條件下適應(yīng)性較強(qiáng)，因此被世界糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）視為全球糧食安全的戰(zhàn)略作物[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)到2050年，全球大米消費(fèi)量將增加到6.5億t，而要滿足日益增長(zhǎng)的人口對(duì)糧食的需求，還需要多生產(chǎn)40%的大米[2]。在過去的幾十年里，傳統(tǒng)的分子育種方法極大地促進(jìn)了水稻產(chǎn)量的提高。然而，近幾十年來水稻產(chǎn)量卻逐漸下降。當(dāng)前農(nóng)業(yè)面臨著人口快速增長(zhǎng)、全球氣候變化、病蟲害以及其他環(huán)境危害等多重挑戰(zhàn)。因此，迫切需要高產(chǎn)潛力、高非生物脅迫耐受性以及抗主要病蟲害病原菌的水稻新品種。

近年來，基因組編輯技術(shù)的出現(xiàn)打破了傳統(tǒng)育種方法的局限性，開創(chuàng)了作物改良的新時(shí)代。基因組編輯主要是對(duì)序列特異核酸酶（SSNs）位點(diǎn)進(jìn)行編輯從而修飾基因組中特定位置的特定基因。目前，SSNs包括鋅指核酸酶（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALENs）和規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)核酸酶9（CRISPR/Cas9）[3]。其中，CRISPR/Cas9是植物生物學(xué)中最先進(jìn)的基因組編輯工具[4-5]。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)

有機(jī)體通過適應(yīng)性免疫保護(hù)自己免受病毒的感染，并通過DNA修復(fù)機(jī)制維護(hù)自己基因組的完整性[1，6]。例如，在細(xì)菌和古生菌中，CRISPR系統(tǒng)是一種針對(duì)病毒感染和質(zhì)粒結(jié)合的自然適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，能夠使特定的微生物對(duì)外來遺傳物質(zhì)做出反應(yīng)并消除它們[1，7-10]。微生物通過轉(zhuǎn)導(dǎo)、結(jié)合、轉(zhuǎn)化接觸外來遺傳物質(zhì)，將外來DNA的短片段整合到CRISPR區(qū)域建立防御系統(tǒng)，從而保護(hù)自身免受基因組入侵[10-11]。CRISPR區(qū)域包含短的重復(fù)堿基序列，被稱為間隔序列，其與噬菌體或質(zhì)粒等外來元素具有序列同源性[6]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型這3種類型。Ⅱ型系統(tǒng)是目前最成功的人工核酸酶，并且被廣泛應(yīng)用于基因組編輯[12]。在Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)中，單一的與CRISPR相關(guān)的核酸內(nèi)切酶蛋白（Cas9）在crRNA（CRISPR RNA）和tracrRNA（trans-activating crRNA）的引導(dǎo)下切割入侵的病毒基因組，從而在PAM[原型間隔序列毗鄰基序，來自釀膿鏈球菌Cas9（Streptococcus pyogenes，簡(jiǎn)稱SpCas9）的NGG]上游3 bp處產(chǎn)生平末端DNA的雙鏈斷裂（DSB）并通過HNH（His-Asn-His）和RuvC核酸酶域分別獲得互補(bǔ)鏈和非互補(bǔ)鏈[7-9，13]（圖1）。另外，sgRNA（single-guide RNA）引導(dǎo)的R-loop（新生RNA與模板DNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)形成的雜合鏈和非模板DNA組成的三鏈結(jié)構(gòu)）保證了互補(bǔ)鏈PAM上游3 bp位置的精確切割[14-15]。編碼Cas蛋白的Cas基因通常位于以富集堿基AT的前導(dǎo)鏈為引導(dǎo)的CRISPR序列附近（圖1）[6，16]。

在植物細(xì)胞中，有2種共同表達(dá)多重引導(dǎo)RNA的方法，用于復(fù)雜基因組的編輯。一是采用基因傳遞方式，將多個(gè)向?qū)NA表達(dá)片段構(gòu)建到單獨(dú)的質(zhì)粒中，如基因槍法和聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染[17]。另一種是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化方法，將多個(gè)sgRNA組裝到1個(gè)載體上。這些sgRNA可以由單獨(dú)的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，或者通過植物內(nèi)源性核糖核酸酶進(jìn)一步加工，以單轉(zhuǎn)錄本的形式表達(dá)[18-20]。這2種方法都是在植物基因組中引入基因修飾的有效方法。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的開發(fā)利用，使得基因組工程得到了驚人的進(jìn)展[21-22]。靶基因的敲除或者敲入在多種物種和細(xì)胞類型中被證明是可行的[9，23]。通過編輯內(nèi)源性基因，開發(fā)出具有改良性狀的新植物或作物，以期克服傳統(tǒng)基因改造生物而產(chǎn)生的負(fù)面影響[24]。考慮到不同的應(yīng)用和生物系統(tǒng)，仍需要不斷地探索發(fā)現(xiàn)新的基因組編輯方法得到最合適的基因組編輯技術(shù)，從而推進(jìn)各個(gè)領(lǐng)域的基因組發(fā)展。

2 CRISPRR/Cas系統(tǒng)在水稻中的應(yīng)用發(fā)展

CRISPR/Cas9系統(tǒng)使用Cas9核糖核酸內(nèi)切酶和向?qū)NA復(fù)合物，在許多物種中顯示了非常高效的靶向基因編輯能力。自2013年以來，CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)在植物中的成功應(yīng)用越來越多，包括對(duì)擬南芥、煙草、高粱、小麥中的成功應(yīng)用，以及在水稻、玉米、大豆、甜橙、毛白楊和番茄中的相關(guān)研究[17-18，25-33]。在水稻中，從T0代植株獲得高頻率的純合或雙等位基因是可行的，且在不出現(xiàn)任何可檢測(cè)到的新突變或回復(fù)突變的情況下，T0代植株中的基因修飾可以持續(xù)到下一代[27]。因此，CRISPR/Cas9技術(shù)讓編輯特定的基因以達(dá)到預(yù)期結(jié)果的設(shè)想成為可能。目前，已有許多研究報(bào)道CRISPR/Cas9技術(shù)在水稻抗病抗逆性，雜種優(yōu)勢(shì)以及產(chǎn)量性狀改良等方面的應(yīng)用（表1）。

2.1 CRISPRR/Cas9系統(tǒng)在水稻抗病性中的應(yīng)用

白葉枯病是我國水稻生產(chǎn)中的重要病害之一，是由白葉枯病菌引起的。該病菌在分蘗期感染植株導(dǎo)致葉片枯萎，嚴(yán)重影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。Jiang等構(gòu)建了一個(gè)由花椰菜花葉病毒（CaMV）的35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的編碼鏈球菌Cas9酶和一個(gè)由水稻U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的sgRNA，該sgRNA的5′區(qū)域與水稻白葉枯病敏感基因OsSWEET14啟動(dòng)子區(qū)域中的20 bp序列互補(bǔ)[25]。通過聚乙二醇（PEG）轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，將Cas9酶和sgRNA共同轉(zhuǎn)化到水稻原生質(zhì)體，并培養(yǎng)48 h，從而使 Cas9-sgRNA 改變目標(biāo)內(nèi)源性基因OsSWEET14的位點(diǎn)。DNA測(cè)序證實(shí)了該水稻原生質(zhì)體細(xì)胞中靶位點(diǎn)的DNA序列發(fā)生突變。為了確定Cas9基因的密碼子優(yōu)化是否會(huì)影響Cas9-sgRNA定向誘變效率，Jiang等還利用一種水稻中優(yōu)化表達(dá)的Cas9基因，對(duì)另一個(gè)水稻白葉枯病基因OsSWEET11進(jìn)行了試驗(yàn)，并且也獲得了多個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)的突變[25];該研究成功證明Cas9-sgRNA系統(tǒng)在農(nóng)業(yè)應(yīng)用中是一種方便且有力的植物基因組編輯方法。

稻瘟病是水稻三大病害之一，由稻瘟病菌引起。稻瘟病幾乎可以破壞水稻不同生長(zhǎng)階段的所有部位。考慮到稻瘟病的嚴(yán)重程度以及對(duì)水稻產(chǎn)量的影響，研究者們通過不同方面控制該病的發(fā)生，包括基因組學(xué)、感染機(jī)制研究、宿主病原體相互作用及抗性育種等。近年來，序列特異性核酸酶（SSNs）已被證明是通過基因特異性基因組編輯改進(jìn)作物的有力工具，其中CRISPR/Cas9被認(rèn)為是最有效的序列特異性核酸酶。Wang等設(shè)計(jì)了一個(gè)CRISPR/Cas9 SSN（C-ERF922）靶向水稻OsERF922基因，使水稻稻瘟病抗性提高;他們從50個(gè)T0代轉(zhuǎn)基因植株中鑒定出21個(gè)C-ERF922誘導(dǎo)突變的植株體，所有由C-ERF922蛋白誘導(dǎo)的等位基因突變都會(huì)遺傳給后代;進(jìn)一步檢測(cè)6個(gè)T2代純合突變系的稻瘟病抗性表型和農(nóng)業(yè)性狀，發(fā)現(xiàn)在幼苗和分蘗時(shí)期，相比于野生型植株，6個(gè)突變體植株中稻瘟病病變顯著減少;結(jié)果表明，通過CRISPR/Cas9基因組修飾對(duì)增強(qiáng)水稻稻瘟病抗性是一個(gè)有效途徑[34]。Pi21是抗稻瘟病基因，因?yàn)榕c高堊白相關(guān)基因緊密連鎖，運(yùn)用傳統(tǒng)方法難以獲得抗稻瘟病且稻米品質(zhì)優(yōu)良的植株。王芳權(quán)等選取Pi21的2個(gè)靶位點(diǎn)，構(gòu)建該基因的敲除載體，對(duì)其進(jìn)行效率分析，發(fā)現(xiàn)2個(gè)靶位點(diǎn)突變效率分別為7857%和92.86%，靶位點(diǎn)同時(shí)突變的效率為 78.57%[35]。另外楊海河等利用日本晴對(duì)Pi20基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，也成功獲得了抗稻瘟病水稻株系[36]。這些研究結(jié)果證明了CRISPR/Cas9技術(shù)推動(dòng)了抗稻瘟病品種的研究進(jìn)展。

2.2 CRISPRR/Cas9系統(tǒng)在水稻抗逆性中的利用

2.2.1 耐鹽性 鹽脅迫對(duì)作物不同發(fā)育階段的生長(zhǎng)都有影響，導(dǎo)致作物產(chǎn)量下降。隨著人口的快速增長(zhǎng)，提高作物的耐鹽性是提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)率的關(guān)鍵措施。在擬南芥中，CBL5的過表達(dá)植株增強(qiáng)了對(duì)高鹽或干旱脅迫的耐受性，因此推測(cè)CBL5可能是植物中抗鹽抗旱性的調(diào)控因子[37]。在水稻中，陳鵬程運(yùn)用CRISPR/Cas9獲得OsCBL5基因敲除純合突變體，發(fā)現(xiàn)其T0代的耐鹽性較野生型明顯提高[38]。董艷敏深入研究OsPDR1基因在水稻中的耐鹽性，利用CRISPR/Cas9技術(shù)定點(diǎn)編輯OsPDR1基因，從而得到該基因的突變株系[39]。與野生型相比，獲得的突變株的耐鹽性明顯提高。因此，CRISPR/Cas9技術(shù)為獲得更優(yōu)質(zhì)的抗鹽性品種提供了一條高效途徑。

2.2.2 抗寒性 水稻幼苗對(duì)低溫特別敏感，尤其在苗期。因此，提高水稻抗寒性對(duì)改善水稻品質(zhì)和產(chǎn)量具有重要意義。為了鑒定參與調(diào)控植物耐冷性的基因，黃小貞等利用由抑制消減雜交技術(shù)構(gòu)建的耐冷基因文庫進(jìn)行篩選，得到一個(gè)可能與水稻耐寒性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子TIFY 1b[40]。為了進(jìn)一步研究TIFY 1b及其同源基因OsTIFY 1a，研究者利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建OsTIFY 1b及其同源基因TIFY 1a的敲除載體，且突變效率高;并在T0代水稻植株中觀察到位點(diǎn)特異性突變，且所有的突變類型都能穩(wěn)定遺傳到下一代[40]。該研究揭示了一種控制水稻抗寒適應(yīng)性的新途徑，有助于拓寬轉(zhuǎn)基因抗寒水稻品種的研究范圍。

2.2.3 抗除草劑性 水稻BEL（bentazon sensitive lethal）基因?qū)Ρ竭_(dá)松和磺酰脲類除草劑具有抗性，BEL基因功能缺失突變體對(duì)除草劑敏感。在二系雜交水稻生產(chǎn)中，以BEL突變體為背景培育雄性不育系時(shí)，只需在苗期噴灑苯達(dá)松即可解決不育系自交雜交種子污染的問題。雖然BEL可能會(huì)提高雜交水稻的安全生產(chǎn)，但有限的自然遺傳資源極大地限制了BEL的應(yīng)用[26]。Xu等設(shè)計(jì)了3種20-nt sgRNAs與水稻抗除草劑基因BEL的PAM序列附近的不同位點(diǎn)配對(duì)，將sgRNA與Cas9整合到一個(gè)載體，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化得到Cas9的轉(zhuǎn)基因水稻植株[26]。通過對(duì)轉(zhuǎn)基因植株基因組上靶位點(diǎn)的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其突變效率為2%～16%，雙等位基因突變的株系表現(xiàn)為對(duì)苯達(dá)松敏感。

3-磷酸合酶（EPSPS）在所有植物和大多數(shù)細(xì)菌中都有保守的基序。這種基序?qū)τ诮Y(jié)合磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）或其競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑草甘膦至關(guān)重要。在保守基序中天然的雙氨基酸發(fā)生T102I+P106S的替換（雙氨基酸替換類型為TIPS）會(huì)產(chǎn)生對(duì)草甘膦的抗性。迄今為止，還沒有在栽培作物中發(fā)現(xiàn)自發(fā)或誘導(dǎo)的TIPS雙重突變，其原因可能是同時(shí)發(fā)生雙核苷酸替換的可能性很低。Li等用一對(duì)sgRNA靶向毗鄰的內(nèi)含子，獲得了2%的EPSPS基因替換頻率，以及2.2%的靶基因插入頻率[41]。獲得的水稻突變株均具有草甘膦抗性，并且特定位點(diǎn)的替換和插入可穩(wěn)定遺傳到下一代。這些新的途徑可以被廣泛運(yùn)用到水稻或其他植物的特定基因組位點(diǎn)中，從而實(shí)現(xiàn)替換靶基因片段和插入內(nèi)源DNA序列。乙酰乳酸合成酶（ALS）是氯磺隆，雙草醚等除草劑中的關(guān)鍵酶，Sun等利用CRISPR/Cas9同源重組成功將多個(gè)離散的點(diǎn)突變轉(zhuǎn)入到水稻ALS基因中[42]。在該研究中不僅獲得了純合的抗除草劑的水稻植株，而且驗(yàn)證了用該Cas9系統(tǒng)精確替換基因是可行且高效的。

因此，利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向關(guān)鍵功能基因有希望成為一種具有較大應(yīng)用前景的促進(jìn)水稻和其他主要作物育種的生物技術(shù)戰(zhàn)略。

2.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻雜種優(yōu)勢(shì)中的利用

由于人口迅速增長(zhǎng)、耕地有限和環(huán)境惡化等，人們對(duì)糧食的需求持續(xù)上升。雜交水稻已經(jīng)在40多個(gè)國家得到開發(fā)利用，在全球糧食供應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[43]。采用三系和二系雜交育種體系開發(fā)的雜交水稻在我國雜交水稻生產(chǎn)中占主導(dǎo)地位[44]。三系法采用細(xì)胞質(zhì)雄性不育性（CMS），恢復(fù)系和保持系來生產(chǎn)雜交種子并維持不育系[45]。三系系統(tǒng)中恢復(fù)系和CMS的遺傳多樣性較低，阻礙了雜交育種的進(jìn)一步發(fā)展。二系育種采用的是光敏核不育系（PGMS）或溫敏核不育系（TGMS）作為特定條件下的不育系或保持系。幾乎所有的水稻品種都能恢復(fù)PGMS和TGMS株系的育性，從而為更好地利用水稻雜種優(yōu)勢(shì)提供更廣泛的遺傳資源。在傳統(tǒng)的育種系統(tǒng)中，開發(fā)商業(yè)化的雄性不育系通常需要幾年時(shí)間，有時(shí)超過10年，而基因工程技術(shù)可以顯著縮短育種時(shí)間。Zhou等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，誘導(dǎo)溫敏核不育（TGMS）基因的特定突變，并且發(fā)展新的純合轉(zhuǎn)基因TGMS系;他們利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在TMS5基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)了10個(gè)靶點(diǎn)用于靶向誘變，并評(píng)估了靶向和脫靶效應(yīng)的潛在發(fā)生率;此外，還建立了最有效的結(jié)構(gòu)——TMS5ab結(jié)構(gòu)（靶向TMS5a基因和TMS5b基因位點(diǎn)的二元結(jié)構(gòu)），用于培養(yǎng)潛在的純合轉(zhuǎn)基因TGMS系[46]。更值得關(guān)注的是，研究者利用TMS5ab結(jié)構(gòu)，在僅僅1年內(nèi)開發(fā)了11種新的轉(zhuǎn)基因TGMS純系，這些純系在雜交育種上都有潛在的應(yīng)用前景[46]。上述研究表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)不僅大大促進(jìn)了TGMS系的育種進(jìn)程，也促進(jìn)雜種優(yōu)勢(shì)的開發(fā)利用。

一直以來，育種家們利用雜種優(yōu)勢(shì)生產(chǎn)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的作物，但遺傳隔離的存在常常導(dǎo)致有益表型在后代中丟失。無融合生殖是利用種子進(jìn)行無性繁殖的一種形式。通過無融合生殖可以實(shí)現(xiàn)F1代雜交種的自交繁殖。Khanday（來自美國加州大學(xué)戴維斯分校Venkatesan Sundaresan教授團(tuán)隊(duì)）等證實(shí)了水稻雜交種無融合生殖的可行性，他們通過基因組編輯敲除BBM1、BBM2、BBM3這3個(gè)基因，結(jié)合卵細(xì)胞中BBM1基因的異位表達(dá)，獲得了克隆后代并保留了全基因組親代的雜合性，并且無融合生殖性狀可以通過多代克隆遺傳到下一代[47]。同一時(shí)期，我國水稻研究所王克劍團(tuán)隊(duì)也通過對(duì)減數(shù)分裂基因REC8、PAIR1、OSD1進(jìn)行CRISPR/Cas9基因組編輯，從而固定了F1雜交稻的雜種優(yōu)勢(shì)，獲得了無性系二倍體配子和四倍體的種子，并且證明了編輯參與受精過程的MTL（MATRILINEAL）基因可以誘導(dǎo)雜交水稻單倍體種子的形成;最后，同時(shí)編輯雜交水稻中REC8、PAIR1、OSD1、MTL這4個(gè)基因，將雜種優(yōu)勢(shì)的固定和單倍體的誘導(dǎo)結(jié)合起來，獲得了無融合生殖植株[48]。這些研究結(jié)果表明，基因編輯技術(shù)對(duì)于水稻雜交種實(shí)現(xiàn)無融合生殖具有重大意義，也為將來在多種作物中實(shí)現(xiàn)F1雜交種的無性繁殖奠定了基礎(chǔ)。

2.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在改善水稻產(chǎn)量性狀中的應(yīng)用

在現(xiàn)代水稻種植中，高產(chǎn)已成為近十年來育種家和種植者的主要目標(biāo)之一。水稻單株產(chǎn)量由3種性狀決定：?jiǎn)沃晁霐?shù)、單穗粒數(shù)、粒質(zhì)量[49-50]。到目前為止，一些基因已被證明會(huì)影響這些產(chǎn)量性狀。控制水稻分蘗的有MOC1（Monoculm1O）、OsTB1（Teosinte Branched1）和IPA1（Ideal plant architecture1）[51-52];調(diào)節(jié)單穗粒數(shù)的有IPA1和Ghd7（Grains Height Date-7）、DST（drought and salt tolerance）、Gn1a（G rain number 1a）[52-54];調(diào)節(jié)籽粒大小的有GS3（Grain Size3）、GW2、GW5（Grain Weight 5）、OsSPL16（Squamosa Promoter Binding Protein-like 16）、OsPPKL1和OsglHAT1[55-61];控制穗型的有DEP1（Dense and Erect Panicle 1）[62]。Li等運(yùn)用CRISPR/Cas9對(duì)水稻品種11號(hào)的Gn1a、DEP1、GS3、IPA1基因進(jìn)行突變，這些基因分別是用來調(diào)節(jié)水稻的單穗粒數(shù)、穗型、谷粒大小、株型[63]。分析T0代轉(zhuǎn)基因植株表型和編輯基因頻率的結(jié)果表明，用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)高效基因組編輯，轉(zhuǎn)基因植物效率分別為42.5%（Gnla）、67.5%（DEP1）、57.5%（GS3）、27.5%（IPA1）。Gn1a、DEP1和GS3突變體的T2代分別表現(xiàn)為谷粒數(shù)的增加、更緊湊直立的株型和較大的籽粒。并且在DEP1和GS3突變體中分別發(fā)現(xiàn)具有半矮稈和長(zhǎng)芒谷粒表型的植株。其中IPA1突變體由于體內(nèi)OsmiR156靶區(qū)域的不同，表現(xiàn)為2種截然不同的表型：產(chǎn)生較少或者較多分蘗。Li等還發(fā)現(xiàn)缺失突變體發(fā)生的頻率高于之前的報(bào)道，且脫靶效應(yīng)發(fā)生在高度相似的靶序列中[63]。這些結(jié)果表明，CRISPR/Cas9可以在1個(gè)品種中修飾多個(gè)重要性狀的調(diào)控因子，從而促進(jìn)對(duì)同一基因組背景下的復(fù)雜基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)剖析，并且為改善目前種植品種產(chǎn)量性狀提供了潛在的植物育種策略。

3 總結(jié)和技術(shù)展望

CRISPR/Cas9系統(tǒng)自2013年推出以來發(fā)展迅速，在糾正疾病突變、對(duì)抗病毒性疾病、解剖基因功能、癌癥研究、細(xì)胞基因組工程、藥物發(fā)現(xiàn)和疾病建模方面正獲得越來越大的影響力。最早在基因組工程中應(yīng)用的釀膿鏈球菌Cas9（SpCas9）蛋白，雖然存在分子量大和潛在的脫靶效應(yīng)等局限性，但由于其高核酸酶活性和廣泛的靶向范圍，仍被廣泛地應(yīng)用。不可否認(rèn)的是，CRISPR/Cas9大大擴(kuò)展了基因組編輯的用途，例如基因敲除的全基因組篩選、轉(zhuǎn)錄抑制或轉(zhuǎn)錄激活、利用不具有切割活性的dCas9與熒光蛋白融合進(jìn)行染色體動(dòng)力學(xué)分析[64-66]、利用dCas9表觀遺傳修飾調(diào)節(jié)因子實(shí)現(xiàn)表觀基因組編輯和利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)細(xì)胞譜系的跟蹤[67-68]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)可以防止細(xì)胞病毒（噬菌體）的感染，為細(xì)菌免疫開辟了一個(gè)新途徑。同時(shí)CRISPR能夠以更精確、更高效、更簡(jiǎn)單的方式在基因組的靶序列上創(chuàng)造突變，已真正成為作物改良的最有效的工具。其主要優(yōu)勢(shì)在于，通過遺傳隔離可以很容易地從基因組中去除那些由轉(zhuǎn)基因技術(shù)引起的基因修飾，從而使經(jīng)過基因編輯的植物與通過傳統(tǒng)育種方法得到的植物之間沒有差異。此外，DNA甲基化和組蛋白修飾的表觀遺傳調(diào)控方式可以在不改變基因組序列的情況下遺傳給植物后代，因此在作物改良方面也有更大的應(yīng)用前景。然而基因組編輯的應(yīng)用仍存在不足，制約了其在水稻等多種作物中的進(jìn)一步應(yīng)用。因此，優(yōu)化基因編輯技術(shù)可以進(jìn)一步促進(jìn)作物改良的發(fā)展。

（1）降低CRISPR基因組編輯系統(tǒng)對(duì)PAM序列的要求。由于對(duì)PAM的要求非常嚴(yán)格，大大限制了可以編輯的序列，從而影響基因組編輯的效率。目前，化膿鏈球菌Cas9（SpCas9）主要是識(shí)別包含NGG的PAM位點(diǎn)[69]。最新開發(fā)的Cas9蛋白，其“D1135”“R1335”“T1337”氨基酸分別被位點(diǎn)“V”“Q”“R”替換（簡(jiǎn)稱VQR變體），該變體被證明可以切割含NGA的PAM位點(diǎn)[70]。然而，該VQR變體的編輯效率較低，限制了其在基因組編輯中的廣泛應(yīng)用。Hu等為了進(jìn)一步擴(kuò)大植物基因組編輯的范圍，通過改造sgRNA結(jié)構(gòu)和強(qiáng)內(nèi)源性啟動(dòng)子，顯著提高了VQR變體的編輯效率[71]。可替換PAM序列（3′ NAG和NGA）和Cas9變體（比如StCas9、SaCas9）拓寬了基因組編輯在植物中的應(yīng)用[72]。使用幾個(gè)具有不同PAM特異性的Cas9變體，將有助于擴(kuò)大基因組編輯的范圍。然而，并不是所有的Cas9變體在植物中都是有效的，Cas9變體仍有很大的發(fā)展空間，并且將有希望擴(kuò)大谷類作物特別是水稻的基因組編輯范圍。

（2）需要提高基因替換編輯的效率。因?yàn)樽魑镉N中需要的性狀是通過功能突變來實(shí)現(xiàn)的，通過同源重組（HR）途徑進(jìn)行的序列置換和片段敲入實(shí)現(xiàn)的基因組編輯對(duì)作物改良具有更重要的意義。但是植物中HR的效率很低，導(dǎo)致通過HR途徑實(shí)現(xiàn)基因替換仍然很困難。因此需要基于HR途徑更高效的基因組編輯。優(yōu)化供體模板DNA的傳遞方式可能是獲得通過HR途徑實(shí)現(xiàn)基因替換編輯的有效途徑。

（3）不能直接在早期的農(nóng)地里獲得經(jīng)過基因組編輯的水稻和其他作物。突變植株在自然環(huán)境條件下的表現(xiàn)存在不確定性。解決這一問題需要對(duì)經(jīng)過編輯的植株進(jìn)行更多的實(shí)地觀察。限制經(jīng)過基因編輯過的水稻應(yīng)用的另一個(gè)因素是農(nóng)民田間生物安全條例。美國農(nóng)業(yè)部已經(jīng)免除了對(duì)許多轉(zhuǎn)基因作物的嚴(yán)格監(jiān)管[73]。歐盟法院最近裁定，使用基因組編輯技術(shù)創(chuàng)造的生物將作為轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)行管理。這可能會(huì)對(duì)水稻種植國家對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻監(jiān)管的決定。總而言之，基因組編輯技術(shù)可以在技術(shù)上創(chuàng)造出轉(zhuǎn)基因作物，CRISPR/Cas9和相關(guān)的基因組編輯工具的確在水稻改良方面帶來了革命性的變化，對(duì)于滿足并保證未來人們對(duì)水稻的需求具有重大意義。

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