高效液相色譜法測定人工牛黃甲硝唑膠囊中膽紅素含量

李香荷，王 強，高燕霞，張 冬，郭 毅，張軼華

（河北省藥品檢驗研究院，河北 石家莊 050011）

人工牛黃甲硝唑膠囊主要用于治療急性智齒冠周炎、局部牙槽膿腫、牙髓炎、根尖周炎等，具有清熱、解毒、祛疾、定驚之功效[1]。牛黃是方中主藥，膽紅素含量是評定人工牛黃其質量的重要指標。2015年版《中國藥典（一部）》[1]人工牛黃項下膽紅素的測定方法為紫外-可見分光光度法，以三氯甲烷為溶劑提取，毒性較大，且紫外測定法易受其他藥味的干擾，因此無法應用到牛黃制劑中。而2015年版《中國藥典（二部）》尚未收載人工牛黃甲硝唑膠囊質量標準，國家藥品標準[2]及文獻[3-7]均采用高效液相色譜法測定人工牛黃甲硝唑膠囊中膽紅素的含量，流動相為甲醇-氯仿-1%磷酸，流動相用到氯仿，氯仿毒性較大，對液相色譜的PEEK管有侵蝕作用，且對色譜柱損傷較大。為此，本研究中參考文獻[8-13]，通過試驗優化了液相條件。現報道如下。

1 儀器與試劑

儀器：Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；UL TRASONIC SD型超聲波清洗器（北京中晟銘科技有限公司）；Metterler XS205型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）。

試藥：膽紅素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為 100077-200805，含量為98.5%，供含量測定用）；人工牛黃甲硝唑膠囊（批號分別為366130201，366130202，366130202，A 企 業 ；批 號 分 別 為F201303011，F201303012，F201303013，B 企業），均為市售品。乙腈（色譜純，德國默克股份兩合公司）；二氯甲烷（分析純，天津市大茂化學試劑廠）；冰醋酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；水為重蒸水。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

取膽紅素對照品適量，精密稱定，加二氯甲烷制成含膽紅素5.53 μg/mL的溶液，得對照品溶液。取本品適量（約相當于人工牛黃2.5 mg），精密稱定，置25 mL棕色容量瓶中，加二氯甲烷20 mL，冰浴超聲20 min使溶解，用二氯甲烷定容，濾過，取續濾液作為供試品溶液。按處方比例配制缺人工牛黃的陰性樣品，按供試品溶液方法制備陰性對照品溶液。

2.2 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 -1%冰醋酸溶液（95 ∶5）；檢測波長：453 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：5 μL。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。理論板數以膽紅素峰計不低于2 000，陰性對照無干擾。

2.3 方法學考察

線性關系考察：取膽紅素對照品11.22 mg，精密稱定，置100 mL棕色容量瓶中，加二氯甲烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成110.5 μg/mL對照品貯備液。精密量取對照品貯備液 0.1，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL，分別置25 mL棕色容量瓶中，加二氯甲烷定容，搖勻，按擬訂色譜條件分別進樣，測定峰面積，以質量濃度（C，μg/mL）為橫坐標、峰面積（A）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為A=4.7×106C-5210（r=0.999 9，n=6）。結果表明，膽紅素質量濃度在0.442～11.05 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

圖1 高效液相色譜圖

精密度試驗：取2.1項下對照品溶液，按擬訂色譜條件連續重復進樣6次，以峰面積計算。結果的RSD為0.40%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批（批號為3661302101）樣品，按2.1項下方法制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件分別進樣，以峰面積計算。結果膽紅素含量為每粒0.0313mg，RSD為0.50%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性考察：取同一供試品溶液，室溫放置，按擬訂色譜條件分別于 0，2，4，6，8，10，12，24 h 時進樣，記錄峰面積。結果的RSD為1.54%（n=8），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：精密稱取已知含量同一批號（批號為366130203）供試品9份，分別精密加入低、中、高3種質量濃度的膽紅素對照品溶液各3份，按供試品溶液方法制備，同法測定，計算回收率。結果見表1。

表1 膽紅素加樣回收試驗結果（n=9）

2.4 樣品含量測定

按2.1項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件，對6批人工牛黃甲硝唑膠囊樣品進行測定，計算膽紅素的含量。結果見表2。

表2 6批人工牛黃中膽紅素含量測定結果（n=3）

3 討論

本試驗溶劑體系下，在300～600 nm波長范圍內掃描對照品溶液，結果在453 nm波長處有最大吸收，與文獻[14]報道結果相同，故確定檢測波長為453 nm。

文獻[3-7]均采用高效液相色譜法測定人工牛黃甲硝唑膠囊中膽紅素的含量，流動相為甲醇-氯仿-1%磷酸，流動相用到氯仿，氯仿毒性較大，對液相色譜的PEEK管有侵蝕作用，且對色譜柱損傷較大，文獻[8，11-13]流動相為乙腈-1%冰醋酸溶液（95∶5），與本研究一致，試驗結果分離效果良好，且峰形對稱性好，靈敏度好，重現性、準確性好，滿足分析方法要求，流動相易得，毒性較小，對色譜柱性能影響很小。

文獻[3，15]報道的膽紅素提取溶劑為氯仿，文獻[4-7，8-10，12]報道的膽紅素提取溶劑除了氯仿和甲醇，還用了鹽酸、磷酸、草酸等作為解離劑。人工牛黃中只含有脂溶性較強的游離膽紅素，包括Ⅸa，Ⅲa和Ⅻa 3種異構體，不溶于水，溶于二氯甲烷、三氯甲烷、苯和二硫化碳等有機溶劑中，而天然牛黃中除了含游離膽紅素，還有結合膽紅素和共價膽紅素，需將后兩者全部解離為游離膽紅素才能測定，多采用鹽酸、磷酸、乙酸、草酸等作為解離溶劑，以二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、二甲基亞砜等作為提取溶劑。本試驗中，人工牛黃中膽紅素為游離膽紅素，故不必使用酸溶液作為解離劑，參考文獻[11，13]，考察了毒性較小的二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇（4 ∶1）和二氯甲烷 -甲醇（2 ∶1）3 種溶劑，并與三氯甲烷做了比較，結果二氯甲烷和三氯甲烷提取效率相同，均高于二氯甲烷-甲醇（4∶1）和二氯甲烷-甲醇（2∶1）。

試驗中進樣量為10，20μL時，峰形均不好；進樣量為5 μL 或小于 5 μL 時，峰形良好。故選擇進樣量 5 μL。