基于Caspase信號(hào)通路研究血府逐瘀湯抑制心肌梗死凋亡的作用和機(jī)制*

孫國(guó)興 ，楊洪慶 ，賈秀鳳 ，呂增祿 △，黃海潮 ，鄭公銘

（1.河北省滄州市人民醫(yī)院，河北 滄州 061000； 2.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州 510520）

傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為，心肌梗死的癥候群主要為心脈瘀阻、氣虛血滯，故多使用活血通脈、行氣化瘀的藥物治療[1]。血府逐瘀湯是清代醫(yī)家王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》中的名方，由桃仁、當(dāng)歸、紅花、枳殼等11味中藥組方，廣泛用于治療多種淤血病證[2]，對(duì)心血管疾病療效確切且安全[3]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，許多心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞的程序性死亡（又稱(chēng)凋亡）密切相關(guān)，心肌細(xì)胞因缺血損傷而引發(fā)凋亡可能是心肌梗死發(fā)病機(jī)制的一個(gè)重要環(huán)節(jié)[4]。半胱天冬蛋白酶家族（Caspase）是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子，根據(jù)起始激活的Caspase不同，凋亡途徑可分為Caspase-8啟動(dòng)的外源性途徑、Caspase-9啟動(dòng)的內(nèi)源性途徑、Caspase-12（鼠類(lèi)）啟動(dòng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑，3種途徑分別涉及炎癥病理、線粒體異常和鈣離子超載等引起心肌損傷凋亡的關(guān)鍵因素[5]。目前，已有學(xué)者通過(guò)檢測(cè)Caspase-3的活性研究血府逐瘀湯抑制心肌缺血和神經(jīng)缺氧引起凋亡的作用[6-7]。但Caspase-3是細(xì)胞執(zhí)行3種凋亡途徑的匯合點(diǎn)，僅對(duì)Caspase-3的研究不能充分說(shuō)明血府逐瘀湯是通過(guò)抑制哪一條途徑發(fā)揮對(duì)缺血心肌的保護(hù)作用[8]。因此，本試驗(yàn)中擬通過(guò)建立大鼠心肌梗死模型，進(jìn)一步研究血府逐瘀湯抑制缺血心肌凋亡的作用和機(jī)制[9]。

1 材料與方法

1.1 材料

動(dòng)物：SPF級(jí)6周齡Wistar雄性大鼠50只，體質(zhì)量（198±9.7）g，購(gòu)于河北大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK （冀）2003-1-003。

試藥：桃仁Semen Persicae，紅花Carthamus tinctoriusL.，當(dāng)歸Angelica sinensis，生地黃Rehmannia glutinosaLibosch.，川芎Ligusticum chuanxiongHort.，赤芍PaeonialactifloraPall.，牛 膝Achyranthes bidentata Blume，桔梗Platycodon Grandiflorum，柴胡Radix Bupleuri，枳殼Citrus aurantiumL.，甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.，均購(gòu)于石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)滄州市人民醫(yī)院主管中藥師呂增祿通過(guò)顯微鏡觀察、薄層色譜、高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜等方法鑒定，均符合現(xiàn)行《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)。血清標(biāo)志物檢測(cè)試劑均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所，相關(guān)蛋白含量測(cè)定試劑盒購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司，活性測(cè)定試劑盒均購(gòu)于美國(guó)Biovision公司，硫化鈉（Na2S）、水合氯醛、蘇木素、伊紅溶液均購(gòu)于上海阿拉丁生化技術(shù)有限公司。

儀器：DK-200BS型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Diatek公司）；AU5800型生化分析儀（美國(guó) Beckma公司）；Elecsys2010型免疫分析儀（羅氏診斷產(chǎn)品＜上海＞有限公司）；VCX750型超聲勻漿器（美國(guó)Cole-Parmer公司）；SorvallST40型臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)ThermoScientific公司）。

1.2 血府逐瘀湯制備

按組方比例，稱(chēng)取桃仁120 g，紅花、當(dāng)歸、生地黃、牛膝各90 g，川芎、桔梗各45 g，赤芍、枳殼、甘草各60 g，柴胡30 g，加入生藥材20倍量純化水，浸泡1 h，加熱保持微沸狀態(tài)煎煮60 min，待煎液冷卻后過(guò)濾渣粒，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將藥液濃縮至含生藥1 g/mL，4℃冷藏備用。試驗(yàn)時(shí)提前取出，水浴加熱至37℃。

1.3 動(dòng)物分組及處理

將50只大鼠隨機(jī)分為模型組、假手術(shù)組和低、中、高劑量（10，20，30 g/kg）藥物組，各 10 只。藥物組大鼠加入純化水稀釋至10 mL后灌胃，每日2次；模型組和假手術(shù)組予10 mL生理鹽水灌胃，每日2次。

1.4 大鼠心肌梗死模型建立

各組大鼠經(jīng)腹腔內(nèi)注射水合氯醛（每100 g體質(zhì)量0.3 mL）麻醉，仰臥固定于操作臺(tái)上，用Na2S溶液脫去胸前雜毛，記錄正常Ⅱ?qū)?lián)心電圖，消毒后剪開(kāi)胸骨，以10號(hào)線荷包縫合；剝離肋間肌肉，于第3～4肋間鈍性開(kāi)胸，充分暴露心臟；在左心耳和肺動(dòng)脈圓錐間找到與左冠狀動(dòng)脈伴行的冠狀靜脈，于左心耳下2～3 mm處用6～0號(hào)無(wú)損傷縫合線結(jié)扎，寬度為0.2～0.3 cm；將心臟沿肋間間隙放回胸腔，迅速擠出胸腔內(nèi)氣體拉緊荷包縫合線縫合切口；假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。手術(shù)后測(cè)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，以心電圖S-T段明顯抬高為模型制備成功的標(biāo)志，術(shù)后肌肉注射青霉素預(yù)防感染[10]。

1.5 觀察指標(biāo)與檢測(cè)

心電圖監(jiān)測(cè)：各組大鼠腹腔注射水合氯醛（每100 g體質(zhì)量0.3 mL）麻醉，仰臥固定于操作臺(tái)上，記錄手術(shù)前、手術(shù)后及給藥7 d的Ⅱ?qū)?lián)心電圖S-T段變化。

心肌損傷血清標(biāo)志物：固定好已麻醉的大鼠，清潔尾部污垢，剪去尾尖2～3 mm，用手從尾根向下輕輕擠壓，將血液收集于離心管中至1.0 mL，靜置30 min，3 000 r/min離心，吸取500 μL血清，按常規(guī)操作流程測(cè)定乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心肌肌鈣蛋白 I（cTnI）及 N末端腦利鈉肽原（NT-pro BNP）、腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）。

HE染色觀察心肌組織形態(tài)及凋亡途徑：將麻醉好的大鼠仰臥固定于操作臺(tái)上，沿劍突開(kāi)始剪開(kāi)胸骨，充分暴露胸腔，剪斷各條血管連通心臟的血管，迅速取出心臟，清除腔內(nèi)血液后，剪成兩部分，一部分置10%多聚甲醛溶液中固定1周，常規(guī)梯度脫水、石蠟包埋，切片，厚度為5 μm，以蘇木素與伊紅進(jìn)行染色，于顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織形態(tài)。另一部分置4℃預(yù)冷冰袋的培養(yǎng)皿內(nèi)剪碎，稱(chēng)取約100 mg，在冰浴條件下用超聲勻漿器制成勻漿，4℃條件下3 000 r/min離心10 min，吸取上清液以微孔濾膜過(guò)濾，二喹啉甲酸（BCA）法測(cè)定各樣品的總蛋白含量，作為參考調(diào)整后續(xù)試驗(yàn)的上樣量。檢測(cè)按照各試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格進(jìn)行操作測(cè)定。鈣蛋白酶（Calpain）的活性以相對(duì)熒光強(qiáng)度（RFI）表示。

氧化應(yīng)激指標(biāo)：稱(chēng)取心肌組織100 mg，按凋亡途徑，冰浴條件下制成勻漿，4℃條件下3 000 r/min離心10 min。吸取上清液，按相應(yīng)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，以酶標(biāo)儀采用比色法檢測(cè)并計(jì)算超氧化物歧化酶（SOD）的活性和丙二醛（MDA）含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，假手術(shù)組與模型組比較采用t檢驗(yàn)，模型組與藥物組比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心電圖S-T段變化

與假手術(shù)組比較，造模后大鼠的心電圖S-T段均明顯抬高（P＜0.01），表明造模成功；與模型組比較，各藥物組S-T段均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降，劑量越高下降趨勢(shì)越大，給藥第5天各組S-T段的下降水平開(kāi)始有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），第6天和第7天下降程度更顯著（P＜0.01）。說(shuō)明血府逐瘀湯對(duì)模型大鼠的心肌梗死狀況具有劑量依賴(lài)性改善作用。詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠心電圖S-T段變化（± s，n=10）

2.2 血清標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清標(biāo)志物各濃度均顯著升高（P＜0.01），表明其心肌組織出現(xiàn)缺血損傷壞死。與模型組比較，各藥物組血清標(biāo)志物濃度均顯著下降（P＜0.05），其中高劑量組下降水平更明顯（P＜0.01），表明各藥物組大鼠的心肌損傷狀況均得到不同程度緩解，且與藥物劑量呈正相關(guān)。詳見(jiàn)表1。

表1 大鼠血清標(biāo)志物濃度檢測(cè)結(jié)果（± s，n=10）

表1 大鼠血清標(biāo)志物濃度檢測(cè)結(jié)果（± s，n=10）

指標(biāo) 假手術(shù)組 模型組CK-MB（U/L）LDH（U/L）cTnI（ng/mL）NT-pro BNP（ng/L）TNF-α（μg/mL）985.02±71.16 164.37±15.87 376.64±30.74 122.08±11.64 1.62±0.45 1 928.27±167.11##248.07±23.54##854.33±71.84##256.21±32.04##2.35±0.57#低劑量組1 709.74±138.20*227.35±13.42*708.47±45.18 223.17±19.30*2.01±0.60*藥物組中劑量組1 523.35±121.19*198.21±15.75*550.47±36.85*198.50±14.35*1.80±0.52*高劑量組1 213.98±98.97**178.37±15.44**422.08±43.56**140.65±17.89**1.70±0.44**

2.3 心肌組織形態(tài)變化

HE染色結(jié)果見(jiàn)圖2。可見(jiàn)，假手術(shù)組心肌組織未見(jiàn)明顯病理形態(tài)改變，細(xì)胞排列緊密，橫紋清晰；模型組大鼠心肌組織病理學(xué)改變較明顯，細(xì)胞明顯腫脹，部分心肌細(xì)胞變性、壞死，肌束排列不整齊，出現(xiàn)較大間隙，并有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；低劑量組細(xì)胞腫脹及肌束紊亂程度較模型組減輕；中劑量組有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞腫脹輕度，肌束紊亂程度有所改善；高劑量組肌束排列較整齊，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)中度，細(xì)胞溶解情況減少。

圖2 HE染色觀察心肌組織的形態(tài)變化（×200）

2.4 Caspase凋亡通路相關(guān)蛋白檢測(cè)結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織中Bcl-2表達(dá)水平顯著下調(diào)而B(niǎo)ax表達(dá)水平則顯著增加（P＜0.01），Bcl-2/Bax比值顯著減少（P＜0.05），Cyt C含量顯著增加（P＜ 0.05），Calpain，Caspase-8，Caspase-9，Caspase-12，Caspase-3活性均增強(qiáng)（P＜0.01），表明模型組缺血心肌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白已相繼激活。與模型組比較，各藥物組隨著用藥劑量的增加，Bcl-2/Bax比值逐漸增加（P＜0.05），Cyt C 含量顯著減少（P＜0.05），Calpain，Caspase-8，Caspase-9，Caspase-12，Caspase-3活性均逐漸下降（P＜0.05），初步表明血府逐瘀湯可從Caspase-8，Caspase-9，Caspase-12 這 3條凋亡途徑抑制心肌細(xì)胞的凋亡。詳見(jiàn)表2。

表2 Caspase凋亡通路相關(guān)蛋白檢測(cè)結(jié)果（± s，n=10）

表2 Caspase凋亡通路相關(guān)蛋白檢測(cè)結(jié)果（± s，n=10）

指標(biāo) 假手術(shù)組 模型組Bcl-2（ng/mL）Bax（ng/mL）Bcl-2/Bax Cyt C（ng/mL）Calpain（RFI）Caspase-8（U/g）Caspase-9（U/g）Caspase-12（U/g）Caspase-3（U/g）50.04±5.78 21.24±2.42 2.36±0.38 18.05±3.17 1.01±0.02 0.75±0.07 0.29±0.04 0.48±0.06 1.31±0.24 27.37±4.22##40.11±5.85##0.68±0.11##39.47±6.12##2.87±0.56##2.68±0.86##0.42±0.03##0.94±0.10##5.46±0.80##低劑量組30.24±5.10*36.51±6.24*0.83±0.16*32.78±5.66*2.47±0.49*1.60±0.62*0.39±0.03*0.86±0.09*3.56±0.75*藥物組中劑量組37.53±6.88*32.77±4.86*1.18±0.49*26.97±5.12*2.01±0.32*1.28±0.53*0.35±0.04*0.74±0.05*2.41±0.34*高劑量組45.37±5.64**25.17±3.88**2.12±0.76**21.07±4.30**1.79±0.25**0.94±0.13*0.32±0.02*0.55±0.04**1.95±0.28**

2.5 MDA含量和SOD活性檢測(cè)結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織中的MDA含量顯著升高，SOD活性顯著下降（P＜0.01），表明大鼠的心肌組織已出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷，細(xì)胞脂質(zhì)結(jié)構(gòu)受到氧化破壞。與模型組相比，各藥物組隨著用藥劑量的增加，MDA含量均逐漸降低（P＜0.05），SOD活性均顯著增加（P＜0.05），其中高劑量組的作用最明顯（P＜0.01），表明血府逐瘀湯能抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)細(xì)胞造成的損傷。詳見(jiàn)圖3。

圖3 心肌組織中MDA含量和SOD活性（± s，n=10）

3 討論

Caspase是一類(lèi)與凋亡密切相關(guān)的蛋白水解酶家族，其成員在氨基酸序列、結(jié)構(gòu)及酶的特性上均相似，通常以無(wú)活性的酶原形式存在大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞中[11]。Caspase酶原必須通過(guò)自身活化或相互激活，重新組裝形成活性復(fù)合物，才能啟動(dòng)凋亡程序。目前，經(jīng)典的細(xì)胞凋亡途徑包括3條由不同Caspase成員啟動(dòng)的途徑。Caspase-8啟動(dòng)的外源性途徑，又稱(chēng)死亡受體途徑；Caspase-9啟動(dòng)的內(nèi)源性途徑，又稱(chēng)線粒體途徑及Caspase-12（鼠類(lèi)）啟動(dòng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。由各條Caspase凋亡通路的信號(hào)傳遞闡明血府逐瘀湯抑制缺血心肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制：1）外源性途徑始于細(xì)胞表面死亡受體Fas、TNFR1（TNF Receptor-1）的激活，當(dāng) FasL（Fas Ligand）和TNF-α等凋亡信號(hào)分子作用于相應(yīng)的受體，使凋亡復(fù)合物在胞內(nèi)逐步形成。凋亡復(fù)合物的死亡效應(yīng)區(qū)可與Caspase-8酶原結(jié)合而使其活化[12]。活化的Caspase-8激活下游的Caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。本試驗(yàn)對(duì)TNF-α和Caspase-8的檢測(cè)結(jié)果表明，血府逐瘀湯可阻止TNF-α參與形成凋亡復(fù)合物，抑制Caspase-8活化，最終避免激活Caspase-3促進(jìn)細(xì)胞凋亡。2）內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑始于線粒體的異常或損傷，因此也稱(chēng)為線粒體途徑。在梗死的心肌組織中，常出現(xiàn)缺血-再灌注的情況，從而導(dǎo)致胞內(nèi)氧自由基發(fā)生累積[13]，線粒體外膜受到氧化損傷[14]，此時(shí)促進(jìn)細(xì)胞存活的Bcl-2和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的Bax表達(dá)量發(fā)生逆轉(zhuǎn)，導(dǎo)致線粒體膜通透性增大[15]，大量Cyt C釋放至細(xì)胞質(zhì)中并激活Caspase-9酶原。活化后的Caspase-9可激活下游的Caspase-3而最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16]。本試驗(yàn)中對(duì)MDA和SOD的檢測(cè)結(jié)果表明，血府逐瘀湯可降低心肌缺血-再灌注產(chǎn)生的氧自由基，通過(guò)上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax表達(dá)量，進(jìn)而抑制Cyt C釋放入胞漿激活Caspase-9，發(fā)揮抗凋亡作用。3）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑主要與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。心肌細(xì)胞的肌質(zhì)網(wǎng)是肌纖維內(nèi)特化的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其通過(guò)膜上的Ca2+-ATP泵將胞質(zhì)中的Ca2+泵入肌質(zhì)網(wǎng)中儲(chǔ)存，當(dāng)心肌組織發(fā)生缺血再灌注時(shí)，肌漿網(wǎng)大量Ca2+釋放入胞質(zhì)，造成Ca2+超載，以致激活鈣依賴(lài)性蛋白酶Calpain，使Caspase-12活化，進(jìn)而激活下游的Caspase-3，形成凋亡程序的聯(lián)級(jí)反應(yīng)[17]。本試驗(yàn)中對(duì)Calpain和Caspase-12的檢測(cè)結(jié)果可從側(cè)面反映，血府逐瘀湯可抑制心肌缺血-再灌注發(fā)生的Ca2+超載，從而阻止Caspase-12活化傳遞凋亡信號(hào)。

天然藥物化學(xué)研究表明，組成血府逐瘀湯的多種藥材中含有大量的黃酮、皂苷、香豆素等活性物質(zhì)，其中黃酮因結(jié)構(gòu)上含有多個(gè)酚羥基而能還原氧自由基和絡(luò)合Ca2+[18]，皂苷可抑制巨噬細(xì)胞釋放TNF-α的抗炎活性[19]，香豆素能抑制血栓形成，維持血流通暢。可見(jiàn)，血府逐瘀湯所含藥效物質(zhì)均可能參與調(diào)控Caspase-8，Caspase-9，Caspase-12這3條凋亡途徑而發(fā)揮保護(hù)缺血心肌的作用。