大蒜素改善糖尿病心肌病大鼠心功能及纖維化的作用及對NF-κB信號通路的影響

陸曉丹，宗剛軍，周建英，張麗君

（中國人民解放軍第101醫(yī)院·江南大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 無錫 214000）

糖尿病性心肌病被定義為心肌的結(jié)構(gòu)和功能異常，與冠狀動脈疾病或高血壓無關(guān)。其調(diào)控機制涉及氧化應(yīng)激、神經(jīng)激素激活、炎癥、鈣穩(wěn)態(tài)受損、線粒體損傷、心肌細胞凋亡和自噬[1]。Toll樣受體（TLR）為先天免疫反應(yīng)的識別受體，可通過損傷相關(guān)分子模式激活，TLR亞型TLR4在心臟中廣泛表達，TLR4參與心肌炎的調(diào)節(jié)，并在缺氧缺血性心臟損傷、肥大型心臟病損傷中起關(guān)鍵作用[2]。核因子 -κB（NF- κB）是調(diào)節(jié)胚胎免疫、細胞凋亡、血管生成、發(fā)育和增殖的主要轉(zhuǎn)錄因子，并可通過TLR4激活。NF-κB介導(dǎo)多種炎性介質(zhì)的基因表達，如細胞間黏附分子-1、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素6[3]。NF-κB與心臟內(nèi)的免疫和應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)[4]。大蒜素是大蒜的活性成分，具有抗氧化、抗炎、神經(jīng)保護、抗菌和抗腫瘤作用；在阿霉素誘導(dǎo)的大鼠心臟毒性模型中，大蒜素降低心肌組織中的一氧化氮水平，并通過降低血清白細胞介素1β（IL-1β）和TNF-α水平顯示出抗炎作用，同時可抑制NF-κB的蛋白表達或核轉(zhuǎn)位[5]。此外，大蒜素可通過降低PI3K/Akt通路的活化，對心肌肥厚和纖維化具有保護作用。本研究中擬探討大蒜素改善糖尿病心肌病大鼠心功能及纖維化的作用及對NF-κB信號通路的影響，為糖尿病心肌病的治療提供理論參考。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器與試藥

清潔級SD大鼠100只，12周齡，體質(zhì)量（119.54±12.34）g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，合格證號為 SCXK（桂）2014-0002。自由攝取飼料、自由飲水，自動控制晝夜循環(huán)（12 h/12 h，光照 7：00 ～19：00），室溫（22±1）℃。試驗嚴(yán)格按照《中華人民共和國實驗動物管理條例》《實驗動物質(zhì)量管理方法》進行。

大蒜素注射液（正大天晴集團股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H32025640，規(guī)格為每支5 mL∶6 mg），根據(jù)成人劑量公式換算，大鼠用藥量為成人的20.13倍，以10.0mL/kg體質(zhì)量灌胃，得藥液濃度為10.0 g/mL。戊四氮（純度99.99%，Sigma公司），TLR4、NF- κB ELISA 試劑盒（上海邦奕生物科技有限公司）；TLR4，NF-κB一抗、二抗（武漢伊艾博科技有限公司）；DAB顯色試劑盒（博士德生物工程有限公司）。熱電MK3型酶標(biāo)儀（美國熱電）。

1.2 分組與給藥

根據(jù)大鼠體質(zhì)量隨機分成對照組（A組），模型組（B組），大蒜素低劑量組（C1組，10.0 mg/kg）、中劑量組（C2組，20.0 mg/kg）、高劑量組（C3組，40.0 mg/kg），每組20只，雌雄各半。B組、大蒜素各劑量組大鼠禁食12 h，腹腔1次性注射鏈脲佐菌素（65 μg/g），7 d后空腹測血糖，血糖大于16.7 mmol/L且出現(xiàn)糖尿病癥狀（多飲、多食、多尿），說明建模成功。高脂飼料喂養(yǎng)3個月，誘導(dǎo)糖尿病心臟損傷，期間大蒜素各劑量組腹腔灌胃給予相應(yīng)藥物，A組和B組給予等體積生理鹽水。試驗結(jié)束后，采用脈沖多普勒檢測各組大鼠心功能指標(biāo)，包括左室舒張早期最大血流/二尖瓣心房收縮期最大血流（E/A）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（FS）。

1.3 檢測指標(biāo)與方法

心肌病變：采用三色（MASSON）染色法觀察各組鼠心肌纖維化程度。

TLR4及 NF-кB mRNA 水平（qRT-PCR 法）：使用RNeasy Mini Kit（Qiagen，Germany）從所有組織樣品中分離總 RNA。使用 Reverse Transcription試劑盒（Applied Biosystem，USA）通過PCR擴增通過逆轉(zhuǎn)錄合成互補DNA（cDNA）；使用 Power SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystem，USA）和用于 TLR4及 NF-κB 的特異性引物在 Lightcycler 96系統(tǒng)（Roche，USA）上進行qRT-PCR。TLR4 正向引物 5′-CTATCGAAGGGACCTAG-3′，反向引物 5′-ACCTACTTCAGCAGGCCTCG-3′；NF-κB 正向引物 5′-CTTCTGGGGACTTCT-3′，反向引物 5′-CTAGTTTCAGCAGGCTTGTC-3′（產(chǎn)品規(guī)格均為150 bp）。β-肌動蛋白用作內(nèi)部對照，引物序列為正向 5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3′反向5′AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′（產(chǎn)物大小 179 bp）。每份樣品的qRT-PCR反應(yīng)一式3份進行。TLR4，NF-κB的qRT-PCR熱曲線為94℃ 10 min、94℃ 30 s、58℃ 35 s、72℃ 1 min；45個循環(huán)。通過相對基因定量方法（2-ΔΔCT方法）計算 mRNA倍數(shù)變化。

TLR4，NF-κB，IL-2，IL-6，TNF-α 水平（ELISA法）：按照無菌條件操作，稱取0.1 g心肌組織，加入少量液氮，在研缽中迅速將心肌碾碎至粉末狀；將組織粉末轉(zhuǎn)入 2 mL Eppendorf管中，加入 1.2 mL PBS（pH 7.4），充分振蕩混勻，2 000 g，4 ℃，離心 20 min。仔細收集上清液。獲取心肌組織勻漿后，采用Elisa法檢測心肌中 TLR4，NF-κB，IL-2，IL-6，TNF-α 蛋白水平。

TLR4及NF-κB蛋白表達水平：通過使用TLR4，NF-κB兔多克隆抗體和抗兔辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二級抗體，在4 μm石蠟包埋的組織切片上進行TLR4及NF-κB蛋白表達的檢測。使用3%過氧化氫溶液和蛋白質(zhì)阻斷試劑來終止蛋白質(zhì)的酶活性和非特異性結(jié)合。組織切片的抗原修復(fù)在Tris EDTA緩沖液（pH 9.0）中進行。用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）底物和Mayer′s蘇木精復(fù)染物檢測陽性染色。以高放大倍數(shù)（40×）觀察500個細胞。在至少5個視野中使用半定量方法對染色的組織切片進行評分。染色標(biāo)準(zhǔn)為0表示 ＜5%陽性染色細胞（陰性表達）；+1表示5% ～20%陽性染色細胞（弱表達）；+2表示21% ～50%陽性染色細胞（中度表達）；+3表示＞50%陽性染色細胞（強表達）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析比較，多重比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α為0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心功能指標(biāo)

由表1可見，與A組比較，大蒜素各劑量組EA，LVEF，F(xiàn)S降低（P＜0.05）；與 B組比較，大蒜素各劑量組 EA，LVEF，F(xiàn)S升高（P＜0.05），且隨著給藥劑量的增加，EA，LVEF，F(xiàn)S逐漸升高，量效關(guān)系明顯（P＜0.05）。

2.2 心肌細胞結(jié)構(gòu)

由圖1可見，A組心肌細胞完整，結(jié)構(gòu)正常，染色清晰，核呈卵圓形位于中央膠，在心肌間質(zhì)及血管周圍見少量亮綠色膠原纖維；B組可見大量肥大、壞死心肌細胞，排列紊亂，且細胞脫失現(xiàn)象明顯，細胞核固縮，心肌纖維化明顯，綠色膠原纖維明顯增加；C3組見少量壞死、肥大心肌細胞，綠色膠原纖維較B組明顯減少；C1及C2組較B組壞死心肌細胞減少，但綠色膠原纖維依然明顯存在，具有明顯的劑量依賴效應(yīng)。

圖1 大蒜素對大鼠各檢測指標(biāo)的影響（400×）

2.3 TLR4，NF-κB mRNA 表達水平

由表1可見，與A組比較，大蒜素各劑量組TLR4及NF-κB mRNA表達水平升高（P＜0.05）；與B組比較，大蒜素各劑量組TLR4及NF-κB mRNA表達水平降低（P＜0.05），且隨著給藥劑量的增加而逐漸降低，量效關(guān)系明顯（P＜0.05）。

表1 各組檢測指標(biāo)水平比較（± s，n=20）

表1 各組檢測指標(biāo)水平比較（± s，n=20）

注：與 A 組比較，*P ＜0.05；與 B 組比較，#P ＜0.05；與 C3組比較，□P ＜0.03。

組別劑量（mg/kg）基因表達 蛋白表達（ng/g） 炎性因子蛋白表達（ng/g）A組B組C1組C2組C3組10 20 40 EA 2.23±0.21 1.39±0.20*1.50±0.19*#1.78±0.20*#2.06±0.18*#心功能指標(biāo)LVEF（%）79.23±2.09 62.24±3.98*65.99±2.03*#70.35±3.26*#76.19±2.79*#FS（% ）58.16±1.02 39.48±5.87*45.14±1.65*#51.29±2.49*#56.34±2.36*#TLR4 mRNA 0.85±0.35 3.58±0.48*3.00±0.28*#2.45±0.54*#1.34±0.28*#NF-κB mRNA 0.78±0.15 2.85±0.34*2.36±0.34*#1.65±0.39*#1.24±0.29*#TLR4 98.54±15.21 268.21±15.21*243.54±14.21*#190.47±11.25*#86.54±12.47*#NF-κB 90.24±910.23 251.36±12.36*234.12±15.21*#189.28±14.19*#134.44±12.763*#IL-2 78.98±16.32 326.21±19.69 261.36±15.32*#□196.32±18.32*#□171.32±24.36*#IL-6 123.65±23.21 413.65±13.69 302.67±19.32*#□203.36±17.32*#□160.68±36.69*#TNF-α 99.36±18.63 589.36±18.34 432.39±15.39*#□269.25±19.99*#□1 393.26±26.39*#

2.4 TLR4及NF-κB蛋白表達水平

由表1可見，與A組比較，大蒜素各劑量組TLR4及 NF-κB蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與 B組比較，大蒜素各劑量組TLR4及NF-κB蛋白表達水平降低（P＜0.05），且隨著給藥劑量的增加而逐漸降低，量效關(guān)系明顯（P＜0.05）。免疫組化法下，TLR4及NF-κB陽性表達為棕褐色，TLR4及NF-κB陽性表達情況與各蛋白表達水平符合。

2.5 IL-2，IL-6，TNF-α 蛋白表達水平

由表1可見，與A組比較，大蒜素各劑量組IL-2，IL-6，TNF-α 蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與 B 組比較，大蒜素各劑量組IL-2，IL-6，TNF-α蛋白表達水平降低（P＜0.05），且隨著給藥劑量的增加而逐漸降低，量效關(guān)系明顯（P＜0.05）。

3 討論

糖尿病心肌病的特征是左心室肥厚、心肌重塑和舒張/收縮功能障礙，以及不成比例地增加的左心室質(zhì)量和心肌纖維化，最終發(fā)展為心力衰竭[6]。在心力衰竭的動物模型中，大蒜素可改善心功能不全和結(jié)構(gòu)異常。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，大蒜素各劑量組EA，LVEF，F(xiàn)S降低；與模型組比較，大蒜素各劑量組EA，LVEF，F(xiàn)S升高，且隨著給藥劑量的增加而逐漸升高，量效關(guān)系明顯。表明大蒜素改善了心臟舒張和收縮功能，結(jié)合病理學(xué)結(jié)果，提示大蒜素減輕了糖尿病大鼠心臟的心室肥大和纖維化。

目前認為，TLR可能在識別免疫系統(tǒng)內(nèi)源性或外源性抗原及炎性反應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的啟動中起重要作用[7]。TLR4可能在炎性細胞因子的合成和釋放中起重要作用，糖尿病心肌病是一種非特異性免疫應(yīng)激反應(yīng)，而TLR4基因的上調(diào)可能與糖尿病心肌病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[8-9]。TLR4在先天免疫反應(yīng)中起重要作用，既是細胞表面的免疫識別受體，又是跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子[10]。當(dāng)TLR4被 PAMP或 DAMP激活時，可激活 MyD88和TRIF依賴性途徑，激活細胞內(nèi)信號分子，如IL-1受體相關(guān)激酶（IRAKs）、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TRAFs）和 TAK1。因此，最終形成激活 NF-κB的主要和次要信號波，NF-κB誘導(dǎo)炎性細胞因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯，并導(dǎo)致炎性介質(zhì)的大量釋放。本研究結(jié)果顯示，NF-κB信號通路的激活被證明是大鼠糖尿病心肌病發(fā)病的核心。通過損傷誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，細菌內(nèi)毒素和細胞因子、NF-κB可被激活[11]。急性炎癥中，NF-κB可調(diào)節(jié)多種炎性基因啟動子，其產(chǎn)物如TNF-α，IL-1β和IL-6對炎癥過程至關(guān)重要。NF-κB活化增強轉(zhuǎn)錄炎性細胞因子和已知的細胞因子，反過來又激活NF-κB[12-14]。本研究結(jié)果顯示，大蒜素能抑制TLR4，NF-κB mRNA及蛋白的表達，抑制炎性因子IL-2，IL-6，TNF-α的表達，且量效關(guān)系明顯。

綜上所述，大蒜素改善糖尿病心肌病大鼠心臟舒張和收縮功能，減輕心室肥大和纖維化程度，其機制可能與大蒜素能抑制炎癥信號通路TLR4及INF-κB mRNA、蛋白表達水平，進而抑制炎性因子IL-2，IL-6，TNF-α的表達有關(guān)。