正交試驗優選藤龍補中方水提工藝*

許聰聰 ，王曉晗 ，梁惠芬 ，林 鷺 ，安紅梅 ，胡 兵 ，浦益瓊 ，張 彤

（1.上海中醫藥大學教學實驗中心，上海 201203； 2.上海中醫藥大學中藥學院，上海 201203；3.上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海 201203）

藤龍補中方系上海中醫藥大學附屬龍華醫院的臨床驗方，主要用于治療大腸癌、胃癌、胰腺癌等惡性腫瘤，由藤梨根、龍葵、蛇莓、白術、茯苓、薏苡仁、槲寄生、半枝蓮等中藥組方[1]。目前，藤龍補中湯配合手術、化學治療（簡稱化療）等方式聯合治療大腸癌，療效明顯[2-4]。藤龍補中湯可促進結腸癌細胞的衰老，抑制大腸癌細胞的轉移，降低化療不良反應，促進大腸癌患者胃腸道功能的恢復[5-7]。在確保原方療效的同時，通過優化提取工藝可制備成固體制劑。本研究中以中醫藥理論為指導原則，在不改變提取溶劑的基礎上，以浸膏得率、野黃芩苷、對羥基桂皮酸和多糖含量為考察指標，對藤龍補中方的水提工藝進行優選，為復方顆粒劑的研究提供樣品和技術積累。現報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：1200型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；BS-124S型電子天平（德國賽多利斯公司）；101-2-5型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海躍進醫療器械廠）；XS105DU型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；RE-52AA型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）。

試藥：藤梨根、龍葵、蛇莓、白術、茯苓、薏苡仁、槲寄生、半枝蓮（上海康橋中藥飲片有限公司，批號分別為161011，161223，160111，160818，160823，170117，160624，161223），經上海中醫藥大學中藥學院張紅梅博士鑒定為正品，均符合2015年版《中國藥典（一部）》相關要求；D-無水葡萄糖對照品（批號為110833-201506），野黃芩苷對照品（批號為110842-201709），均購自中國食品藥品檢定研究院；對羥基桂皮酸對照品（上海譽恩生物科技有限公司，批號為7400-08-0）；甲醇（批號為 R6AG1H）、乙腈（批號為 S8HA1H）均為色譜純（Honeywell公司），其他試劑均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。

圖1 高效液相色譜圖

2 方法與結果

2.1 野黃芩苷含量測定[8]

2.1.1 色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱：DiamonsilTMPlus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 -0.1% 磷酸溶液（39 ∶61）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：335 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

2.1.2 溶液制備

取野黃芩苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度為1.028 g/L的對照品貯備液。取浸膏粉約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇溶液100 mL，超聲10 min，搖勻，過濾，即得供試品溶液。

2.1.3 方法學考察

線性關系考察：取對照品貯備液適量，加甲醇制得質量濃度分別為 8.224，20.56，51.4，128.5，257，514，1 028 μg/mL的系列對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，以質量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，得回歸方程Y=30.919X-0.613 36，r=0.9995（n=7）。結果表明，野黃芩苷質量濃度在8.224～1028g/L范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：分別精密吸取質量濃度為20.56，128.5，514 μg/mL 對照品溶液，各 10 μL，注入液相色譜儀，連續測定6次。結果的RSD分別為1.31%，0.69%，0.23%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取浸膏，平行測定6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結果的RSD為1.44%（n=6），表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

重復性試驗：取浸膏，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結果平均含量為1.42%，RSD為1.53%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的浸膏9份，分別加入相當于樣品含量50%，100%，150%的對照品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=3）

2.2 對羥基桂皮酸含量測定[9-10]

2.2.1 色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱：UltimateXB-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈 -0.2%醋酸溶液（14∶86）；流速：1.0mL/min；檢測波長：300 nm；柱溫：25 ℃ ；進樣量：10 μL。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

2.2.2 溶液制備

取對羥基桂皮酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度為1.04 g/L的對照品貯備液。取浸膏粉約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇溶液25 mL，超聲20 min，搖勻，過濾，即得供試品溶液。

2.2.3 方法學考察

線性關系考察：取對羥基桂皮酸對照品貯備液適量，加甲醇制成質量濃度分別為0.784 375，1.568 75，3.137 5，6.275，12.55，25.1，50.2 μg/mL 的系列對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，以質量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，得回歸方程Y=70.579X-17.853，r=0.999 9（n=7）。結果表明，對羥基桂皮酸質量濃度在0.784 375～50.2 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：分別精密吸取質量濃度為1.568 75，6.275，25.1 μg/mL 的對照品溶液，各 10 μL，注入液相色譜儀，連續測定6次。結果的RSD分別為1.18%，1.17%，0.42%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，按擬訂色譜條件于24 h內間隔一定時間進樣6次。結果的RSD為2.00%（n=6），表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

重復性試驗：取浸膏，平行6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結果平均含量為0.026 4%，RSD為1.52%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的浸膏9份，分別加入相當于樣品含量50%，100%，150%的對照品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結果見表1。

2.3 多糖含量測定[6，11-12]

2.3.1 溶液制備

取干燥至恒定質量的D-無水葡萄糖對照品8.77mg，置10 mL容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，配制成質量濃度為877 μg/mL的對照品貯備液。取浸膏粉約0.1 g，精密稱定，加5 mL水使其完全溶解，加入95%乙醇，攪拌均勻，4℃冰箱靜置過夜，過濾，沉淀用95%乙醇洗滌3次，干燥。將干燥后的沉淀全部溶解于100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，過濾，即得供試品溶液。

2.3.2 測定方法

取供試品溶液1.0 mL，置試管中，加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，混勻，沸水浴中加熱15 min后，迅速冷卻至室溫，于487 nm波長處測定吸光度，計算多糖含量。

2.3.3 方法學考察

線性關系考察：取葡萄糖對照品貯備液適量，加水制備成質量濃度 分別 為 19.294，29.818，38.588，49.989，70.16，79.83 μg/mL 的系列對照品溶液，精密吸取1.0 mL，加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，混勻，沸水浴中加熱15 min后，迅速冷卻至室溫，以相應試劑為空白，于487 nm波長處測定吸光度（A）值，以 A（Y）為縱坐標、質量濃度（X）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=9.9X+12.9，r=0.999 7（n=6）。結果表明，D-無水葡萄糖質量濃度在19.294～79.83 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：分別稱取質量濃度為29.818，49.989，79.83 μg/mL的對照品溶液適量，按擬訂色譜條件測定吸光度，連續測定6次。結果的RSD分別為0.11%，0.15%，0.03%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，按擬訂色譜條件于24 h內間隔一定時間測定6次。結果的RSD為2.70%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

重復性試驗：取浸膏，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定吸光度。結果平均含量為13.49%，RSD為2.47%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的浸膏9份，分別加入相當于樣品含量50%，100%，150%的對照品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定。結果見表1。

2.4 水提工藝優選

選擇浸泡時間（因素A）、加水量（因素B）和提取時間（因素C）為考察因素[13]，以浸膏得率（指標Ⅰ）、野黃芩苷（指標Ⅱ）、對羥基桂皮酸（指標Ⅲ）及多糖（指標Ⅳ）含量的綜合評分為考察指標，權重系數設為0.25。稱取處方量藥材，按L9（34）正交表設計試驗，試驗安排及結果見表2，方差分析見表3。

表2 藤龍補中方水提工藝正交試驗分析

表3 水提工藝方差分析

由方差分析可知，因素A（溫度）、因素B（溶劑用量）和因素C（提取時間）均對結果的影響無顯著性，因此采用直觀分析結果。各因素的最佳搭配為A3B2C1，即采用浸泡0 h，溶劑用量（10+8）倍，提取時間2 h；為節約能源，溶劑用量不變，提取時間調整為1 h。

按優選的水提工藝提取，經3批驗證試驗，所得浸膏中野黃芩苷、對羥基桂皮酸和多糖含量分別為1.39%，0.027 9%和15.25%，RSD分別為 2.79%，0.67%和2.82%，浸膏得率為15.89%，RSD為1.78%（n=3），表明該水提工藝穩定、可行。

3 討論

測定野黃芩苷含量時，曾分別考察了提取溶劑（50% ，70% ，100%甲醇）、溶劑用量（10，25，50，100 mL）及超聲時間（10，20，30 min）對野黃芩苷提取率的影響。結果表明，當取樣量為0.25 g，提取溶劑為50%甲醇100 mL，超聲提取10 min，野黃芩苷提取率較高。

測定對羥基桂皮酸含量時，也曾分別考察了提取溶劑（50%，70% ，100% 甲醇）、溶劑用量（10，25，50 mL）及超聲時間（10，20，30 min）對對羥基桂皮酸提取率的影響。當取樣量為0.2 g，提取溶劑為50%甲醇50 mL，超聲提取20 min，對羥基桂皮酸的提取率較高。

野黃芩苷為半枝蓮的主要成分，在該成分的測定過程中，先采用與2015年版《中國藥典（一部）》半枝蓮藥材項下含量測定方法一致的甲醇-水-醋酸（35∶61∶4，V∶V∶V）流動相進行測定，由于野黃芩苷色譜峰與相鄰峰未分開，未達到要求。初步考慮該復方成分較復雜，可能是某類黃酮類化合物對其造成了影響，需重新調整流動相。現行藥典中燈盞細辛含有野黃芩苷，以甲醇-0.1%磷酸溶液（40∶60，V∶V）為流動相，并根據具體情況將流動相調整為甲醇-0.1%磷酸溶液（39∶61，V∶V），可獲得較好的色譜峰分離效果。

在建立了3種活性成分含量測定方法的基礎上，以綜合評分法優選該方的水提工藝。選定的3個指標成分中，野黃芩苷和多糖成分的抗腫瘤作用顯著。半枝蓮中的黃酮類化合物在體內外都有顯著的消除自由基的作用[14]，對人結腸癌細胞株SM480有抑制作用[15]；此外，該復方水提物中含有大量多糖成分，也具有良好的抗腫瘤作用。其中，半枝蓮多糖能抑制HepA小鼠腫瘤生長，降低H22肝癌小鼠瘤重[16]，提高C26結腸癌小鼠的腫瘤組織凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的活性發揮抗腫瘤作用[17]；茯苓多糖對胃癌、乳腺癌、肝癌均能起到一定的抑制作用[18]；藤梨根中的有效成分獼猴桃根多糖可通過抑制PCNA蛋白的過速增殖而抑制結腸癌和肝癌的增殖[19]；龍葵多糖能顯著抑制小鼠U14細胞的增殖，延長荷瘤小鼠的生存時間，是治療宮頸癌的有效物質，龍葵中分離得到的糖蛋白類成分能抑制結腸癌細胞HT-29和HCT-116細胞株的增殖，提示該藥中糖蛋白類成分可能是抗結腸癌的藥效物質[20]。