右美托咪定或BNIP3基因siRNA對PC12細胞凋亡的影響

李坤旺 馮智英 樊理華 彭志友 陳苗妙 章玲賓 徐巧敏 游敏吉

(1浙江大學醫學院附屬第一醫院疼痛科，浙江 杭州 310003；麗水市人民醫院 2麻醉科；3重癥醫學科)

隨著社會老齡化，越來越多老年患者因各種疾病需要手術治療，而多種神經退行性病常在老年人發生，且發病率呈現出逐年上升趨勢〔1,2〕。神經退行性病發生發展與氧化應激存在密切關系〔3〕。過氧化氫(H2O2)是一種常用的引起細胞發生應激的誘導劑，在細胞凋亡模型建立中有廣泛的應用，研究表明，H2O2可誘導大鼠腎上腺嗜鉻瘤(PC)12細胞凋亡〔4〕。因此，本研究也使用H2O2作用PC12細胞凋亡的誘導劑。右美托咪定(DEX)是一種具有高度選擇性的α腎上腺素受體激動劑，具有輕度麻醉、鎮痛及鎮靜等作用，多項研究表明，DEX對神經有保護作用。如DEX可保護低氧、利多卡因等因素誘導的PC12細胞損傷〔5,6〕。但DEX對H2O2誘導的PC12細胞凋亡及機制研究尚未明確。Bcl-2腺病毒E/B19 kDa相互作用蛋白(BNIP3)是B淋巴細胞癌基因(Bcl)-2家族中BH3-only亞家族的一個成員，發揮促凋亡作用，可誘導胰腺癌、骨肉瘤等多種腫瘤凋亡〔7,8〕，BNIP3對PC12細胞凋亡的影響研究較少，有研究顯示，低氧條件可上調BNIP3表達，BNIP3表達抑制可降低由低氧誘導的PC12細胞損傷〔9〕，但BNIP3對H2O2誘導的PC12細胞凋亡影響及機制尚未明確。本研究旨在探討DEX及BNIP3 siRNA單獨或聯合對H2O2誘導的PC12細胞凋亡影響及機制。

1 材料與方法

1.1細胞及主要試劑和儀器 PC12細胞購自美國ATCC。DEX購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；噻唑藍(MTT)、2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)均購自美國Sigma；細胞凋亡試劑盒購自江蘇凱基；BNIP3、核因子(NF)-κB p65、κB抑制蛋白激酶(IKK)α和Bcl-2抗體均購自美國CST；Multiskan酶標儀購自美國Thermo；FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD。

1.2轉染 PC12細胞在含有10%胎牛血清(FBS)及青霉素和鏈霉素各100 U/ml的完全杜爾伯克改良基礎培養基(DMEM)培養基(瓶底鋪0.1 mol/L的多聚賴氨酸)中，于37℃、5%體積分數CO2培養箱中培養。細胞處于生長對數期且達70%生長融合時，以2×106/ml密度接種于6孔板，孵育24 h后分別轉染靶向抑制BNIP3的siRNA(si-BNIP3組)，并同時轉染陰性對照siRNA(NC組)及設置空白組，siRNA由上海吉瑪設計及合成，轉染參照LipofectamineTM2000說明(美國，Invitrogen 公司)。轉染48 h，收集細胞，用于實驗研究。

1.3分組及處理 PC12細胞分為NC組、H2O2組、DEX組、si-BNIP3組和DEX+si-BNIP3組，均無血清培養24 h，除NC組外，均給予200 μmol/L終濃度的H2O2，處理24 h后DEX組加入100 μmol/L DEX處理48 h，si-BNIP3組轉染靶向抑制BNIP3的siRNA 48 h，DEX+si-BNIP3組加入100 μmol/L DEX后瞬時轉染靶向抑制BNIP3的siRNA。

1.4MTT法檢測細胞活力 接種PC12細胞于96孔板，每孔5×103個細胞，體積200 μl，培養24 h后按照1.3分組處理，處理至規定時間后加MTT溶液(5 mg/ml)，每孔20 μl，孵育4 h后終止培養，將培養上清液吸出，加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，震蕩混勻10 min，490 nm波長，酶標儀測定各孔的吸光度值(A值)。實驗重復3次。

1.5流式細胞術檢測細胞凋亡率 預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌按照1.3分組處理至規定時間的細胞，取(5～10)×104重懸的細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用適量1×結合緩沖液懸浮細胞，加入5 μl的Annexin V-FITC，混勻后再加入10 μl的碘化丙啶(PI)，避光室溫反應15～20 min，上機前加入1×結合緩沖液400 μl，1 h內上機，流式細胞術檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.6流式細胞術檢測ROS含量 以(1～2)×104/ml密度接種PC12細胞的細胞懸液于培養瓶內，細胞貼壁生長達80%～90%時，參照1.3分組處理細胞，收集處理至規定時間的細胞，懸浮細胞于含DCFH-DA(終濃度10 μmol/L)的無血清培養液中，37℃孵育20 min，流式細胞儀檢測。由于ROS探針DCFH-DA本身不含熒光，但能穿過細胞膜，在胞內的ROS可將不帶熒光的DCFH氧化為有熒光生成的DCF，因此檢測DCF的熒光強度可反映出細胞內ROS水平。

1.7Western印跡法 放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液適量提取細胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法對蛋白定量，每孔道上樣40 μg總蛋白，經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，蛋白分離后電轉聚偏氟乙烯(PVDF)膜，膜轉好后用5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜，4℃搖床孵育BNIP3、NF-κB p65、IKKα和Bcl-2抗體(均為1∶1 000稀釋)過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗體，室溫孵育1.5 h，ECL顯色。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參，Quantity軟件分析各蛋白條帶灰度值。實驗重復3次。

1.8統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行方差分析，SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1BNIP3 siRNA轉染PC12細胞效果 si-BNIP3組 BNIP3表達(0.084±0.010)顯著低于空白組(0.506±0.046，P<0.05)，而NC組BNIP3表達(0.518±0.050)與空白組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 BNIP3 siRNA轉染PC12細胞后BNIP3蛋白表達電泳圖

2.2DEX或BNIP3 siRNA對PC12細胞活力的影響 H2O2刺激可明顯降低PC12細胞活力(0.268±0.035)，與NC組(0.722±0.063)比較差異有統計學意義(P<0.05)，而DEX(0.455±0.046)及BNIP3 siRNA(0.512±0.053)均可促進PC12細胞活力，與H2O2組比較差異顯著(P<0.05)，聯合使用DEX和BNIP3(0.703±0.074)對細胞活力促進作用更明顯，與DEX組和si-BNIP3組比較差異顯著(P<0.05)。

2.3DEX或BNIP3 siRNA對PC12細胞凋亡的影響 H2O2組細胞凋亡率〔(36.86±3.78)%〕顯著高于NC組〔(3.02±0.34)%〕，DEX組和si-BNIP3組細胞凋亡率〔(23.14±2.11)%、(20.56±2.03)%〕顯著低于H2O2組，顯著高于DEX+si-BNIP3組〔(9.23±0.72)%，P<0.05〕 見圖2。

圖2 DEX或BNIP3 siRNA對PC12細胞凋亡的影響

2.4DEX或BNIP3 siRNA對PC12細胞ROS水平的影響 H2O2組細胞ROS水平(熒光強度47.54±3.11)顯著高于NC組(20.15±0.76)，DEX組和si-BNIP3組細胞ROS水平(熒光強度34.26±2.24，30.06±20.02)顯著低于H2O2組，顯著高于DEX+si-BNIP3組(23.32±1.47，P<0.05)。

2.5DEX或BNIP3 siRNA對PC12細胞NF-κB信號的影響 H2O2組細胞NF-κB p65和IKKα的蛋白表達水平顯著高于NC組(P<0.05)，Bcl-2的蛋白表達水平顯著低于NC組(P<0.05)；DEX組和si-BNIP3組細胞NF-κB p65和IKKα的蛋白表達水平顯著低于H2O2組(P<0.05)，顯著高于DEX+si-BNIP3組(P<0.05)，Bcl-2的蛋白表達水平顯著高于H2O2組(P<0.05)，低于DEX+si-BNIP3組(P<0.05)。見圖3，表1。

1～5:NC組、H2O2組、DEX組、si-BNIP3組、DEX+si-BNIP3組圖3 DEX或BNIP3 siRNA對PC12細胞NF-κB信號的影響

表1 5組NF-κB p65、IKKα、PCNA和Bcl-2的蛋白相對表達量比較

與NC組比較：1)P<0.05；與H2O2組比較：2)P<0.05；與DEX+si-BNIP3組比較：3)P<0.05

3 討 論

氧化應激與多種慢性及急性神經退行性疾病密切相關，雖機制尚未明確，但氧化應激可誘導細胞發生凋亡〔3〕。H2O2是ROS的一個主要活性成分，可以跨膜進入細胞，是常用的一種氧化應激誘導劑。有研究表明，在脂多糖、TNF-α等凋亡促進因素作用下，凋亡細胞內H2O2的含量明顯增多，且H2O2的暴露可引起原代神經細胞、PC12細胞等多種細胞發生凋亡，且多項研究已使用H2O2建立PC12細胞凋亡模型〔10,11〕，因此，本研究也使用H2O2作為PC12細胞凋亡的誘導劑。

DEX作為一種麻醉輔助藥在臨床上有廣泛的應用，DEX對神經損傷有一定的保護作用。如DEX可減低由谷氨酸引起的PC12細胞損傷〔12〕；DEX可增加由氧氟化碳(COCl2)引起的PC12細胞存活率降低，且抑制細胞的凋亡〔13〕。有研究表明，50～200 μmol/L的DEK均可降低由H2O2誘導的PC12細胞凋亡，因此本研究選擇100 μmol/L的DEK作為研究對象〔14〕。細胞凋亡調控是一個復雜的過程，死亡受體途徑及線粒體途徑是各種凋亡信號的主要傳遞途徑，可活化細胞內caspase，因而引起細胞的死亡。BNIP3隸屬于Bcl-2蛋白超家族，是一個促凋亡蛋白，在多種腫瘤中表達沉默，過表達BNIP3可抑制腫瘤細胞的生長〔15〕。在神經損傷中BNIP3的研究較少，有研究發現，缺氧、腦缺血再灌注損傷可上調BNIP3表達，引起神經細胞凋亡，而下調BNIP3表達可降低神經細胞凋亡〔16〕。目前RNA干擾(RNAi)在基因功能研究、疾病治療等方面應用廣泛〔17〕。本研究發現BNIP3 siRNA及DEX均可增加PC12細胞活力，抑制細胞凋亡，合用對細胞活力及凋亡影響更明顯。這提示BNIP3 siRNA及DEX可產生疊加效應用于神經損傷保護。

ROS可快速地影響酶、膜脂質及一些其他的細胞成分，進而引起細胞的凋亡。已證實H2O2引起的PC12細胞凋亡與ROS在細胞內含量增加有關〔18〕。本研究發現BNIP3 siRNA和DEX均可降低PC12細胞ROS水平，兩者聯合降低ROS水平更明顯。這提示ROS水平降低可能是BNIP3 siRNA和DEX抑制PC12細胞凋亡的一條途徑。眾所周知，MAPK、NF-κB等多種信號通路對細胞凋亡具有調節作用，NF-κB是一個核轉錄因子，幾乎在所有的真核細胞中存在，有研究表明，NF-κB信號活化可導致PC12細胞凋亡，而抑制NF-κB信號可通過調節下游抑凋亡蛋白Bcl-2、凋亡抑制因子survivin等與凋亡相關蛋白的表達而抑制細胞凋亡〔19,20〕。本研究結果顯示，BNIP3 siRNA及DEX均可下調NF-κB信號NF-κB p65和IKKα，上調Bcl-2表達，兩者合用對NF-κB p65和IKKα表達抑制及Bcl-2表達促進作用更明顯。這提示BNIP3 siRNA及DEX對PC12細胞凋亡的影響與抑制NF-κB信號有關。