麥冬多糖對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響

陳碧珊 吳紅衛(wèi) 李艷 張濱 沈勇剛

(廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1藥學(xué)部臨床藥學(xué)科,廣東 廣州 510000；2康復(fù)科)

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1是TGF-β超家族中活性最強(qiáng)的亞型，參與細(xì)胞增殖凋亡、免疫調(diào)節(jié)、胚胎發(fā)生、創(chuàng)傷修復(fù)等的調(diào)控〔1，2〕。研究表明，TGF-β1參與心肌病、心肌梗死后心力衰竭、高血壓心肌肥厚等多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，且可引起心肌細(xì)胞凋亡〔3，4〕。目前也有大量研究使用TGF-β1建立心肌細(xì)胞凋亡模型〔5，6〕。麥冬為常用的滋陰中藥，主要化學(xué)成分為多糖類和皂苷，麥冬多糖(MDG-1)是從麥冬中分離純化后得到的均一分子量的β-D-果聚糖〔7〕。研究表明，MDG-1對(duì)心肌缺血損傷具有改善作用〔8〕，但MDG-1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制尚未明確。本研究以大鼠心肌細(xì)胞H9c2為研究對(duì)象，使用TGF-β1建立心肌細(xì)胞損傷模型，旨在觀察MDG-1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響，并進(jìn)一步探究其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑和儀器 大鼠H9c2心肌細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究所細(xì)胞庫(kù)。噻唑藍(lán)(MTT)試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma；膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基；增殖細(xì)胞抗原(PCNA)、B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2、p53、核因子(NF)-κB p65、KB抑制蛋白激酶(IKK)α和β-catenin抗體均購(gòu)自美國(guó)CST；Multiskan酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo；FACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，培養(yǎng)條件：37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%、適度飽和。實(shí)驗(yàn)選擇生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞。

1.3分組及處理 H9c2心肌細(xì)胞分為對(duì)照組、TGF-β1組和MDG-1組。對(duì)照組及TGF-β1組均加入DMEM培養(yǎng)液，MDG-1組加入100 mg/L MDG-1，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，于37℃恒溫、飽和濕度及5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，棄掉上清，對(duì)照組加DMEM培養(yǎng)液，TGF-β1組和MDG-1組加入20 ng/ml TGF-β1，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集細(xì)胞，用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.4MTT檢測(cè)細(xì)胞活力 以1×105個(gè)/ml的密度接種H9c2心肌細(xì)胞于96孔板，每孔加入細(xì)胞懸液200 μl，于37℃、飽和濕度及5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁后，棄去上清，按照1.3方法處理細(xì)胞，收集處理后繼續(xù)培養(yǎng)12 h的3組細(xì)胞，加入MTT溶液，每孔20 μl，于37℃恒溫、飽和濕度及5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄掉上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10 min，酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)定各孔的吸光度值(A值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。以3×105個(gè)/ml的密度接種生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的H9c2心肌細(xì)胞于96孔板，分組及處理方法同1.3，收集處理至規(guī)定時(shí)間的3組細(xì)胞，預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞，胰酶消化后收集細(xì)胞。用400 μl 1倍結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，細(xì)胞懸浮液中加入Annexin V-FITC染色液5 μl，混勻后避光4℃冰箱孵育15 min，再加入PI染色液10 μl，混勻后避光4℃冰箱孵育5 min，上機(jī)前再加入300 μl 1倍結(jié)合緩沖液，1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)活性氧(ROS)水平 收集按照1.3分組處理12 h的3組細(xì)胞，用終濃度為10 μmol/L DCFH-DA的無(wú)血清培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，于37℃條件下孵育細(xì)胞20 min，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。由于ROS探針DCFH-DA本身是無(wú)熒光，但能穿過(guò)細(xì)胞膜，且ROS可以將細(xì)胞內(nèi)不含有熒光的DCFH氧化為產(chǎn)生熒光的DCF，因此通過(guò)檢測(cè)DCF的熒光強(qiáng)度可間接反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7Western印跡 收集按照1.3分組處理12 h的3組細(xì)胞，適量細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法進(jìn)行蛋白定量，每孔道上樣等量總蛋白，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠進(jìn)行蛋白分離，然后將蛋白通過(guò)電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜，加一抗(1∶1 000稀釋的PCNA、Bcl-2、p53、NF-κB p65、IKKα和β-catenin抗體)，4℃孵育過(guò)夜，洗膜，加二抗，室溫孵育1.5 h，用電化學(xué)發(fā)光(ECL)進(jìn)行顯色。以GAPDH為內(nèi)參，用gel pro4.0軟件分析各目的蛋白與GAPDH蛋白的灰度值比值，其比值即為各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞活動(dòng)比較 TGF-β1組細(xì)胞活力(A值：0.302±0.025)顯著低于對(duì)照組(0.687±0.054，P<0.05)，MDG-1組(0.529±0.047)顯著高于TGF-β1組(P<0.05)。3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=58.622，P=0.000)。

2.2各組細(xì)胞凋亡率比較 TGF-β1組細(xì)胞凋亡率(30.26%±3.05%)顯著高于對(duì)照組(3.12%±0.03%，P<0.05)，MDG-1組(10.54%±0.98%)顯著低于TGF-β1組(P<0.05)。3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=172.525，P=0.000)，見圖1。

2.3各組ROS水平比較 TGF-β1組ROS水平(熒光強(qiáng)度：86.42±3.26)顯著高于對(duì)照組(32.18±1.57，P<0.05)，MDG-1組(53.55±2.41)顯著低于TGF-β1組(P<0.05)。3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=355.472，P=0.000)。

2.4MDG-1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 TGF-β1組PCNA和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組，p53蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；MDG-1組PCNA和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著高于TGF-β1組，p53蛋白表達(dá)顯著低于TGF-β1組(P<0.05)，見圖2，表1。

2.5MDG-1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)及NF-κB信號(hào)的影響 TGF-β1組β-catenin、NF-κB p65和IKKα蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，MDG-1組顯著低于TGF-β1組(P<0.05)，見圖3，表2。

圖1 MDG-1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響

圖2 MDG-1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞PCNA、Bcl-2和p53蛋白表達(dá)的影響

表1 各組PCNA、Bcl-2和p53蛋白表達(dá)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與TGF-β1組比較：2)P<0.05;下表同

圖3 MDG-1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞β-catenin、NF-κB p65和IKKα蛋白表達(dá)的影響

表2 各組β-catenin、NF-κB p65和IKKα蛋白表達(dá)

3 討 論

心腦血管疾病具有致殘率高、復(fù)發(fā)率高和死亡率高的特點(diǎn)，且有較多的并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅人類的生命健康〔9〕。研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞除進(jìn)行自身的分裂、再生外，還參與病變組織修復(fù)及心臟自穩(wěn)態(tài)的維護(hù)〔10〕。在多種心血管疾病中，心肌細(xì)胞的凋亡貫穿于整個(gè)過(guò)程，因此，有效降低心肌細(xì)胞凋亡對(duì)于心血管疾病治療具有重要意義。我國(guó)中藥資源豐富，植物多糖在抗腫瘤、抗衰老、免疫活性調(diào)節(jié)、心血管疾病等方面均發(fā)揮重要作用。目前對(duì)MDG-1在心血管疾病方面的研究較少，有研究發(fā)現(xiàn)，MDG-1可改善心肌缺血造成的損傷〔8〕，20～200 mg/L MDG-1對(duì)心肌細(xì)胞無(wú)明顯的細(xì)胞毒性〔11〕。因此，本研究選擇100 mg/L的MDG-1。心肌細(xì)胞凋亡可能是非缺血和(或)缺血性心肌病患者心肌細(xì)胞死亡的一種形式，心肌細(xì)胞一旦發(fā)生凋亡，原有的心肌將被膠原纖維取代，繼而引起心室重構(gòu)、心肌肥厚、心肌纖維化等，最終導(dǎo)致心力衰竭。研究表明，在心力衰竭過(guò)程中TGF-β1表達(dá)急劇增加，且在TGF-β1刺激下可引起心肌細(xì)胞凋亡〔12〕。因此，在多種心血管疾病研究中使用TGF-β1建立心肌細(xì)胞損傷模型。本研究結(jié)果顯示，MDG-1可逆轉(zhuǎn)TGF-β1對(duì)心肌細(xì)胞活力的抑制作用，抑制由TGF-β1引起的心肌細(xì)胞凋亡。可見，MDG-1對(duì)心肌凋亡具有抑制作用。

氧化應(yīng)激是生物體一個(gè)正常的生命活動(dòng)，ROS是重要的氧化應(yīng)激水平反應(yīng)指標(biāo)。有研究表明，ROS的過(guò)度產(chǎn)生可激活下游的一些促進(jìn)細(xì)胞重構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子及信號(hào)激酶，也可引起心肌纖維細(xì)胞的增生，使在細(xì)胞外的基質(zhì)金屬蛋白酶激活，最終導(dǎo)致心肌基質(zhì)重構(gòu)〔13，14〕。也有研究指出，抑制ROS水平可降低心肌細(xì)胞凋亡〔15〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MDG-1可降低由TGF-β1引起的心肌細(xì)胞ROS水平的升高，提示MDG-1降低心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制可能與降低氧化應(yīng)激有關(guān)。Wnt/β-catenin信號(hào)是Wnt信號(hào)中的經(jīng)典信號(hào)通路，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、生長(zhǎng)發(fā)育及分化等〔16〕。研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)在健康成人心臟中是沉默的，而在多種心血管疾病中該信號(hào)被持續(xù)激活，從而可引起細(xì)胞凋亡〔17〕。NF-κB是一個(gè)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。有研究表明，在多種心血管病中該信號(hào)通路被活化，可引起細(xì)胞凋亡〔18〕；也有研究指出，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)和NF-κB信號(hào)可通過(guò)對(duì)下游的增殖凋亡相關(guān)的PCNA、p53、Bcl-2、Bax的調(diào)節(jié)影響心肌細(xì)胞增殖和凋亡〔19～21〕。本研究結(jié)果提示，MDG-1對(duì)心肌細(xì)胞活力及凋亡的影響與抑制Wnt/β-catenin信號(hào)和NF-κB信號(hào)有關(guān)。

綜上，MDG-1可增強(qiáng)心肌細(xì)胞活力，抑制心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平及抑制Wnt/β-catenin和NF-κB信號(hào)有關(guān)。本研究?jī)H為細(xì)胞水平的檢測(cè)，且未進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，因此還需進(jìn)一步的證實(shí)。