敲低Tribbles同源蛋白3抑制血管緊張素Ⅱ誘導的心肌成纖維細胞增殖

熊勇 彭定鳳 胡勇鈞 唐哨勇 冮洪生

(華中科技大學同濟醫學院附屬普愛醫院心血管內科，湖北 武漢 430033)

心肌纖維化是心肌梗死后常見的病理過程，心肌成纖維細胞過度增殖是心肌纖維化發生的重要原因之一，血管緊張素(Ang)Ⅱ是心肌纖維化發生的誘導因子，在心肌纖維化過程中表達水平上調〔1〕。體外研究顯示，AngⅡ可誘導心肌成纖維細胞增殖和膠原合成〔2〕。Tribbles同源蛋白(TRIB)3是一個蛋白激酶，參與調控細胞增殖過程，TRIB3參與動脈粥樣硬化、糖尿病心肌纖維化等病理過程〔3,4〕。目前研究顯示，TRIB3在高糖誘導的心肌成纖維細胞中表達上調，敲低其表達可抑制高糖誘導的心肌成纖維細胞纖維化過程，而對于TRIB3在AngⅡ誘導心肌成纖維細胞增殖和膠原合成中的作用尚不清楚〔5,6〕。本實驗用AngⅡ處理心肌成纖維細胞，探討TRIB3在AngⅡ誘導心肌成纖維細胞增殖和膠原合成中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 出生24 h的SD乳鼠由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供；羥脯氨酸檢測試劑盒購自南京建成生物科技有限公司；AngⅡ購自美國Sigma公司；SYBR實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒、放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液購自上海貝博生物科技有限公司；細胞RNA提取試劑盒購自大連寶生物工程公司；GAPDH抗體、TRIB3抗體、Ⅰ型膠原(COLLⅠ)抗體、Ⅱ型膠原(COLLⅡ)抗體和基質金屬蛋白酶(MMP)-2抗體購自美國Abcam；引物由金斯瑞生物科技有限公司合成；一氧化氮(NO)含量檢測試劑盒、誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)活性檢測試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司；TRIB3 siRNA慢病毒載體和陰性對照慢病毒載體由吉滿生物科技(上海)有限公司構建。

1.2心肌成纖維細胞分離培養 用差速貼壁法分離培養心肌成纖維細胞〔7〕，無菌條件下取出生24 h的乳鼠心臟，放在4℃預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，洗滌3次以后，用75%的酒精浸泡30 s，PBS洗滌，把心臟剪碎(組織塊約1 mm3)，在組織中添加等體積的0.1%的COLLⅡ酶和0.125%的胰蛋白酶，37℃水浴中消化，每10 min震蕩1次，組織塊完全消失后收集消化懸浮液，添加細胞培養液(含10%胎牛血清的DMEM培養基)，離心后，添加培養液懸浮，種植到培養瓶內，放在37℃，5%CO2培養箱內，貼壁60 min后，吸除上清，加入細胞培養液繼續培養。分離培養的細胞經波形蛋白免疫熒光鑒定呈陽性，結蛋白免疫熒光檢測呈陰性，鑒定為心肌成纖維細胞。取第3代心肌成纖維細胞進行實驗。

1.3AngⅡ處理的心肌成纖維細胞中TRIB3表達變化 心肌成纖維細胞分別用含0.0、0.1 μmol/L AngⅡ的培養液培養，記為空白對照組和AngⅡ組，細胞在培養24 h后用qRT-PCR和Western印跡法檢測細胞中TRIB3表達變化。

qRT-PCR：收集空白對照組和AngⅡ組細胞，在細胞中添加總RNA提取試劑(TRIZOL)裂解液，按照RNA提取試劑盒步驟提取待測樣品的RNA進行反轉錄，反轉錄步驟同cDNA合成試劑盒。按照SYBR qRT-PCR試劑盒進行定量PCR，記錄每個反應的Ct值，按照2-△△Ct法計算TRIB3表達水平。GAPDH：上游引物：5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，下游引物：5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。TRIB3：上游引物：5'-TGTCTTCAGCAACTGTGAGAGGACGAAG-3'，下游引物5'-GTAGGATGGCCGGGAG-CTGAGTATC-3'。

Western印跡法：收集空白對照組和AngⅡ組細胞，在細胞中添加RIPA裂解液，置于冰水混合物上裂解30 min后，用細胞刮刀收集細胞，4℃高速離心，吸取上清液并分裝，二喹啉甲酸(BCA)法定量蛋白。配制5%的濃縮膠和10%的分離膠，將待測蛋白樣品加入到上樣緩沖液中，在100℃孵育3 min后，加入到上樣孔內，每孔添加30 μg蛋白樣品。100 V恒壓電泳，觀察Mark進入到分離膠的底部后，斷開電源，進行轉膜。100 mA電流轉膜70 min，轉膜溫度控制在4℃。把轉膜后的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜取出，放在含有5%牛血清白蛋白封閉液的平皿中，室溫中孵育30 min。再將PVDF膜放在TRIB3抗體孵育液中4℃過夜，與辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗在室溫孵育90 min后，電化學發光顯色，分析每組樣品目的蛋白TRIB3和內參蛋白GAPDH灰度值，以二者比值表示TRIB3蛋白水平。

1.4細胞分組和轉染 心肌成纖維細胞中轉染TRIB3 siRNA慢病毒載體和陰性對照慢病毒載體，步驟如下：取心肌成纖維細胞，接種到24孔板內，細胞融合率為50%時，在細胞中添加慢病毒液，同時加入聚凝胺，培養20 h后換液，第3天觀察熒光表達情況，以嘌呤霉素篩選后用于后續實驗。把轉染TRIB3 siRNA慢病毒載體和陰性對照慢病毒載體的心肌成纖維細胞用含0.1 μmol/L的AngⅡ培養液培養記為TRIB3 siRNA組和siRNA-NC組，空白對照組、AngⅡ組處理方法同1.3。 AngⅡXEG 、siRNA-NCXEG 、TRIB3 siRNAXEG 細胞培養24 h后，用qRT-PCR和Western印跡法檢測TRIB3 siRNA對AngⅡ條件下心肌成纖維細胞中TRIB3表達的干擾效果，步驟同1.3。

1.5噻唑藍(MTT)檢測細胞增殖 空白對照組、AngⅡ組、siRNA-NC組、TRIB3 siRNA組細胞分別接種到96孔板內，每孔加100 μl的細胞懸浮液(含5 000個細胞)，繼續培養24 h后，每孔內加入20 μl的MTT溶液，37℃孵育4 h。棄上清，添加150 μl的二甲基亞砜(DMSO)溶液，測定每孔490 nm的A值，以不含細胞的孔調零。

1.6羥脯氨酸法檢測膠原合成 空白對照組、AngⅡ組、siRNA-NC組、TRIB3 siRNA組細胞分別培養24 h后，吸取培養液進行檢測，準備測定管、空白管和標準管，空白管內添加500 μl的雙蒸水，標準管內添加500 μl的標準應用液，待測管內添加500 μl的待測樣品，每個管內加入50 μl的消化液，均勻混合后，37℃孵育3 h。按照試劑盒說明書在每管內加500 μl的試劑一，室溫孵育10 min后，添加500 μl的試劑二，混合后，室溫中孵育5 min，添加1 ml的試劑三，混合，60℃孵育15 min，冷卻后，離心，吸取上清溶液，檢測550 nm的A值，用蒸餾水調零，計算膠原含量。膠原含量=待測樣品稀釋倍數×標準管濃度×(待測管A值-空白管A值)÷(標準管A值-空白管A值)

1.7Western印跡法檢測細胞中COLLⅠ、COLLⅡ和MMP-2蛋白表達 空白對照組、AngⅡ組、siRNA-NC組、TRIB3 siRNA組細胞培養24 h后檢測細胞中COLLⅠ、COLLⅡ和MMP-2蛋白水平，步驟同1.3。

1.8NO含量和iNOS活性變化檢測 空白對照組、AngⅡ組、siRNA-NC組、TRIB3 siRNA組細胞培養24 h后，收集培養液上清，按照硝酸還原法檢測各組培養液中NO含量，酶聯免疫吸附試驗檢測培養液中iNOS活性。具體操作步驟參照試劑盒標準流程。

1.9統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1AngⅡ誘導心肌成纖維細胞中TRIB3 mRNA和蛋白的表達 AngⅡ組心肌成纖維細胞中TRIB3蛋白和mRNA水平均明顯高于空白對照組(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 Western印跡法檢測AngⅡ處理后的心肌成纖維細胞中TRIB3蛋白表達

表1 AngⅡ處理后的心肌成纖維細胞中TRIB3表達變化

2.2TRIB3 siRNA對AngⅡ條件下心肌成纖維細胞中TRIB3蛋白和mRNA表達的影響 TRIB3 siRNA組心肌成纖維細胞經AngⅡ處理后，TRIB3蛋白和mRNA水平均明顯低于AngⅡ組和siRNA-NC組(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 Western印跡法檢測TRIB3 siRNA對AngⅡ條件下心肌成纖維細胞中TRIB3蛋白表達

表2 各組心肌成纖維細胞中TRIB3表達情況

與siRNA-NC組、AngⅡ組比較:1)P<0.05

2.3下調TRIB3抑制AngⅡ條件下心肌成纖維細胞增殖和膠原合成 與空白對照組比較，AngⅡ組心肌成纖維細胞A490值明顯升高，同時培養液中膠原含量也明顯升高(均P<0.05)。與AngⅡ組、siRNA-NC組比較，下調TRIB3后的TRIB3 siRNA組經AngⅡ誘導后，細胞A490值顯著下降，培養液中膠原含量顯著降低(均P<0.05)。見表3。

表3 心肌成纖維細胞A490值和培養液中膠原含量變化

AngⅡ組與空白對照組比較:1)P<0.05；與AngⅡ、siRNA-NC組比較:2)P<0.05；下表同

2.4下調TRIB3對AngⅡ條件下心肌成纖維細胞中COLLⅠ、COLLⅡ和MMP-2蛋白表達影響 與空白對照組比較，AngⅡ組COLLⅠ、COLLⅡ蛋白水平明顯升高，MMP-2蛋白水平明顯降低(均P<0.05)。與AngⅡ組和siRNA-NC組比較，TRIB3 siRNA組COLLⅠ、COLLⅡ蛋白水平降低，MMP-2蛋白水平明顯升高(均P<0.05)。見圖3、表4。

2.5下調TRIB3促進AngⅡ條件下心肌成纖維細胞分泌NO 與空白對照組比較，AngⅡ組NO含量、iNOS活性顯著降低(均P<0.05)。與AngⅡ組、siRNA-NC組比較，TRIB3 siRNA組NO含量、iNOS活性顯著升高(均P<0.05)。見表5。

1～4：空白對照組、AngⅡ組、siRNA-NC組、TRIB3 siRNA組圖3 Western印跡法檢測下調TRIB3對AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞中COLLⅠ、COLLⅡ和MMP-2蛋白表達

表4 心肌成纖維細胞中COLLⅠ、COLLⅡ和MMP-2蛋白水平變化

表5 心肌成纖維細胞培養液中NO含量和iNOS活性變化

3 討 論

心肌纖維化是各種類型心臟疾病發生的共同原因，心肌纖維化的發生與心肌間質細胞修復有關，其中心肌成纖維細胞是關鍵〔8,9〕。心肌成纖維細胞可以分泌胞外基質如COLLⅠ、COLLⅡ，進而參與組織重建過程，與此同時，心肌纖維化時心肌成纖維細胞合成的MMP-2等膠原降解酶減少也是心臟膠原沉積的重要原因之一〔10〕。AngⅡ是一種神經內分泌因子，在心肌纖維化過程中發揮主導作用，AngⅡ具有誘導心肌肥厚、心力衰竭等作用，持續的AngⅡ可誘發心臟內大量的膠原沉積，導致膠原體積變大，使心肌間正常組織結構受到破壞，引起心肌纖維化的發生〔11,12〕。AngⅡ刺激可誘導心肌成纖維細胞增殖并大量合成膠原〔13〕。本實驗結果表明，AngⅡ處理后的心肌成纖維細胞增殖能力升高，細胞合成的膠原水平也升高，同時細胞中COLLⅠ、COLLⅡ蛋白表達水平升高，細胞中MMP-2蛋白水平下降，AngⅡ誘導心肌成纖維細胞纖維化發生，成功構建了心肌成纖維細胞纖維化模型。

TRIB3是在果蠅中發現的一種與胚胎發育有關的蛋白激酶，參與細胞應激反應，營養缺乏、缺氧等都可誘導TRIB3蛋白表達，TRIB3參與細胞增殖、凋亡、運動等多種功能調節過程〔14〕。目前對于TRIB3在細胞生長凋亡中的作用研究不同，在胰島β細胞中的研究顯示，TRIB3過表達可抑制高糖環境下的胰島β細胞增殖〔15〕。在Corcoran等〔16〕的研究中表明，TRIB3可促進細胞增殖，減少細胞凋亡。TRIB3參與心肌纖維化過程，在心肌纖維化過程中表達上調，敲低TRIB3可減少高糖誘導的心肌成纖維細胞膠原合成，TRIB3在心肌纖維化中可能發揮促進作用〔5,17～19〕。本實驗表明，敲低TRIB3可逆轉AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞增殖和膠原合成，減少細胞中COLLⅠ、COLLⅡ蛋白表達，促進MMP-2蛋白表達，敲低TRIB3能夠通過降低AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞增殖發揮抗纖維化作用。

NO是一種心肌纖維化調節因子，在心肌肥厚、心力衰竭等過程中發揮抑制作用，NO具有舒張血管的作用，在心肌纖維化過程中合成水平降低，NO水平的高低還與心肌成纖維細胞的增殖能力有關，iNOS是與組織損傷關系最為密切的iNOS，在心肌纖維化中活性降低〔20～24〕。本研究顯示，AngⅡ抑制iNOS活性并減少心肌成纖維細胞合成的NO，而敲低TRIB3可逆轉AngⅡ對心肌成纖維細胞iNOS活性和NO合成的影響，敲低TRIB3可能通過影響心肌成纖維細胞NO的合成發揮抗心肌纖維化作用。

綜上，敲低TRIB3具有抗AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞纖維化作用，敲低TRIB3能夠抑制心肌成纖維細胞增殖和膠原合成，敲低TRIB3還可促進心肌成纖維細胞合成NO。