行為學干預對血管性癡呆大鼠腦組織保護及SDF-1、β-catenin表達的影響

邱月 呂威力 邢雪松

(沈陽醫學院 1解剖學教研室，遼寧 沈陽 110034；2病理學教研室)

缺血性腦損傷是嚴重影響人類健康生活的疾病，擁有高發病率、高致殘率、高復發率等特性〔1～3〕。腦缺血能促進成年動物大腦神經干細胞(NSCs)的增殖、遷移和分化，一些受損的神經元可被新生的神經元替換，對改善神經功能缺損有積極影響〔4〕。神經生長因子家族的成員腦源性神經生長因子(BDNF)和膠質源性神經營養因子(GDNF)，有研究發現腦組織釋放以上兩種神經生長因子，對缺血缺氧性腦損傷具有修復作用〔5～7〕。本研究探討氣味穿梭訓練干預對血管性癡呆大鼠腦組織保護及基質細胞衍生因子(SDF)-1、β-連環蛋白(catenin)表達的影響。

1 材料和方法

1.1血管性癡呆模型的制備 健康雄性Wistar大鼠，體重均在230 g左右，約8周齡，共計54只。購于沈陽醫學院實驗動物管理中心。將全部大鼠隨機分為3組：假手術組(6只)，模型組(3、7、14、21 d,每組6只)，訓練組(3、7、14、21 d,每組6只)。建立血管性癡呆大鼠模型采用兩血管阻斷加硝普鈉法。常規禁食水。術前麻醉采用1%戊巴比妥鈉，40 mg/kg腹腔注射，大鼠取仰臥位，碘伏消毒頸前區，行正中切口約為3 cm，分離左、右側頸總動脈，分離時應防止迷走神經過度牽拉，模型組大鼠注射硝普鈉，腹腔注射劑量為2.5 mg/kg，立即用無創動脈夾夾閉雙側頸總動脈，10 min后打開動脈夾，10 min后再次夾閉動脈，10 min后再打開，縫合頸前切口，恒溫37℃飼養大鼠，必要時可應用抗生素抗感染。應用多導生物記錄儀測量并記錄實驗動物血壓，大鼠平均動脈壓103～105 mmHg，硝普鈉注射后血壓平均值下降至約50 mmHg，約持續2 min，后血壓平均值緩慢上升至70 mmHg持續約1 h。在建模過程中采取保溫措施將手術動物肛溫維持在37℃,因為低溫在一定程度上減輕腦缺血損傷。假手術組手術僅分離頸總動脈，不采取阻斷及硝普鈉降壓，余同模型組。造模1 d后訓練組開始進行氣味訓練，此后分別于3、7、14、21 d后處死取材。

1.2氣味穿梭訓練 本次實驗的條件刺激與非條件刺激分別為乙酸異戊酯香味與電流刺激。先將大鼠放入穿梭箱一側，進行5 min暗適應，后給予持續氣味刺激。假設大鼠未逃向穿梭箱另一側，則給予電流刺激，電流大小約為10 mA，大鼠逃至穿梭箱另一側(箱底未通電)停止刺激，否則持續電流刺激5 s。下一輪訓練前確保氣味無殘留。造模成功后，第2天開始氣味穿梭訓練，每次訓練進行20輪氣味、電刺激。

1.3行為學評分 各組大鼠麻醉清醒后采用Zea Longa法進行神經行為學評分，評分標準為：0分：無神經受損表現；1分：前爪未能完全舒展；2分：大鼠向前走時向兩側晃動；3分：大鼠行走時身體向兩側傾倒；4分：不可自主行走，有意識喪失。去除評分為0分與4分的實驗動物，用建模成功大鼠替換以保證每小組大鼠數量恒定，在大鼠缺血再灌注3 d后再次進行行為學評分，記錄分析評分結果。

1.4BNDF和GDNF含量的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測 模型組和氣味訓練組大鼠缺血再灌注3 d后，采用戊巴比妥鈉大劑量麻醉，迅速斷頭取腦，在冰盤上快速剝離大腦雙側皮質，采用冰生理鹽水漂洗腦組織，濾紙吸干生理鹽水，稱重記錄詳細數據，保存在凍存管中置于液氮中待用。按上述步驟取大鼠腦皮質，準確稱重后，加入9倍體積的生理鹽水制成10%的勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清液保存于-70℃冰箱。ELISA法檢測腦組織中BNDF和GDNF的含量，具體步驟均照說明書推薦進行操作。

1.5SDF-1和β-catenin的免疫組織化學檢測 取各組缺血海馬組織(AP前囟-3.14～前囟-4.5 mm)，片厚約5 mm，置于固定液中固定超過24 h，采用免疫組織化學染色法(IHC)檢測缺血海馬組織中 SDF-1和β-catenin的表達情況。羊血清封閉(37℃，30 min)，一抗選用兔抗鼠 SDF-1和β-catenin(4℃，過夜)，滴加二抗(37℃,60 min)，滴加ABC復合物(37℃，60 min)，每步之間均磷酸鹽緩沖液(PBS)充分漂洗。二氨基聯苯胺(DAB)染色時間不超過10 min，流水洗凈染色液，脫水、透明、封片。空白組一抗，采用PBS緩沖液代替。

1.6統計學處理 采用SPSS12.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1行為學評分 假手術組神經功能缺損行為學評分(0.00±0.00)分。訓練組評分〔(2.35±0.31)分〕明顯低于模型組〔(3.01±0.27)分，P<0.05〕，訓練組及模型組行為學評分均顯著高于假手術組(P<0.05)。

2.2BNDF和GDNF含量 模型組及訓練組與假手術組相比，腦組織BNDF和GDNF明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，訓練組BNDF和GDNF含量明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組腦組織中BNDF和GDNF含量比較

與假手術組比較：1)P<0.05;與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.3氣味訓練對SDF-1結果的影響 假手術組可見極少量表達SDF-1陽性的細胞，分散在海馬組織中，3、7、14、21 d各亞組之間比較無統計學意義(P>0.05)。模型組7 d缺血海馬SDF-1陽性細胞為增長趨勢,大小不均,呈簇狀分布。隨著缺血再灌注時間逐漸延長，表達SDF-1的陽性細胞減少。與假手術組比較，模型組及訓練組3、7、14、21 d陽性細胞明顯增高(P<0.05)。訓練組3、7、14、21 d海馬組織表達SDF-1的細胞均較模型組明顯增多(P<0.05)。見表2、圖1。

表2 各組SDF-1及β-catenin陽性細胞的平均灰度值

2.4氣味訓練對β-catenin的影響 假手術組大鼠海馬組織β-catenin呈弱陽性表達。模型組第7天β-catenin陽性細胞數較假手術組明顯升高，陽性細胞數隨著灌注時間的增加而逐漸增多，高表達延續至再灌注后第14天，直至第21天(P<0.05)。訓練組大鼠海馬神經元細胞質內可清楚觀察到棕褐色顆粒，與模型組各亞組比較β-catenin陽性細胞數均明顯增多(P<0.05)。見表2、圖2。

圖1 大鼠海馬SDF-1陽性細胞(×200)

圖2 大鼠海馬β-catenin陽性細胞(×200)

3 討 論

血管性癡呆是由一系列腦血管因素導致大腦缺血缺氧進而引起的癡呆綜合征，以智能衰退、表情淡漠、性格和情緒改變為主要臨床表現〔8,9〕。

在小鼠基質細胞中SDF-1首次被分離出來，其主要特點是刺激前 B 細胞發育。存在SDF-1α 和 SDF-β2種亞型，SDF-1α和SDF-β分別編碼89個氨基酸和93個氨基酸的多肽，但2種亞型均含有一個 21 個氨基酸組成的信號裂解肽〔10，11〕。多種腫瘤的形成、增殖、轉移和血管形成均有SDF-1參與，從而被廣泛研究。

Wnt/β-catenin 信號通路在神經再生領域中發揮重要。在干細胞表面Wnt 蛋白和Frizzled受體和低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRPs)結合，通過募集基因轉移酶(KAT)3的活化因子CREB 錨定蛋白(CBP)激活轉錄因子 β-catenin 的轉錄，從而促進干細胞分化相關基因的表達〔12,13〕。

本研究發現，通過氣味穿梭訓練能明顯降低模型組大鼠的行為學評分，提升腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中BNDF和GDNF的含量，推測提高腦內源性神經營養因子的表達是氣味穿梭訓練發揮缺血腦保護的作用機制之一。

本實驗又通過氣味穿梭訓練觀察對缺血再灌注后大鼠海馬SDF-1和β-catenin的表達變化，通過實驗數據得出結論，訓練組大鼠腦組織SDF-1和β-catenin表達較模型組顯著增多，又從一個側面探討氣味訓練通過SDF-1/β-catenin 信號通路發揮缺血腦保護的作用機制。