肺抑瘤膏對Lewis肺癌種植瘤PI3K/AKT通路的影響

彭召云 鄭心 李龍祥 李士濤

(山東中醫藥大學 1第二附屬醫院呼吸科，山東 濟南 250001；2康復學院；3濟南市中心醫院功能檢查科)

肺癌又稱原發性支氣管肺癌，發病率及死亡率逐年增高〔1〕。非小細胞肺癌(NSCLC)約占肺癌發病率的86.3%〔2〕，放化療治療有諸多的不良反應及局限性〔3，4〕，近年來中醫學在腫瘤領域的治療中取得了顯著成效。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路在腫瘤細胞的生長、存活、增殖、凋亡、血管生成等過程中具有重要作用〔5〕。研究發現，PI3K/AKT信號通路貫穿于NSCLC的發生發展過程，活化的PI3K/AKT通路通過激活下游多種信號轉導而促進腫瘤進展〔6〕。研究發現中藥可有效抑制PI3K/AKT信號轉導通路的AKT位點，促進肺癌細胞的凋亡〔7〕。本實驗根據前期研究〔8～10〕復制Lewis肺癌小鼠模型，以化療藥順鉑作對照，采用免疫印跡法、免疫組化檢測PI3K/AKT信號通路蛋白，探討肺抑瘤膏抑瘤的作用機制。

1 材料及方法

1.1材料及用藥 瘤株來源：Lewis肺癌荷瘤雄性小鼠2只購于國家實驗細胞資源共享平臺，荷瘤傳3代后進行實驗。實驗小鼠：C57BL/6近交系雄性小鼠(許可證號SCXK(魯)20140007)，6～8周齡，體重(18±2)g。AKT抗體(CST#4691)、PI3K抗體(CST#4257)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR，CST#2983)、通用型SP檢測試劑盒#SP-9000 WK152108(中杉金橋)；十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)配制試劑盒#P0012A(碧云天生物技術)。肺抑瘤膏(1 ml膏方相當于生藥量4.3 g)由山東中醫藥大學第二附屬醫院藥劑科按照膏方制備工藝流程制備，分裝保存備用。注射用順鉑：規格20 mg，齊魯制藥有限公司，產品批號：1WA2A15040258。

1.2造模方法 將C57BL/6荷瘤小鼠采用脫頸椎法處死，酒精消毒，在超凈工作臺上用已滅菌的剪刀、鑷子完整剝離腫瘤組織，于冰上研磨并制備細胞懸濁液，離心計數后調整細胞濃度為1.0×107/ml，在小鼠腋窩下接種腫瘤細胞懸液0.2 ml/只(約含瘤細胞2.0×106個)。注射后見小鼠腋窩處形成一圓形透明水泡即為成功〔11〕。

1.3分組及給藥 當能用游標卡尺在小鼠腋下測到瘤體時，按照SPSS統計軟件隨機分為模型組、肺抑瘤膏低劑量組、肺抑瘤膏中劑量組、肺抑瘤膏高劑量組、順鉑組、順鉑加肺抑瘤膏中劑量組共6組，12只/組。參照徐叔云等〔12〕主編的《藥理實驗方法學》第三版，中藥給藥劑量相當于60 kg成年人按公斤/體重折算劑量的等效劑量。各組給藥如下：每天灌胃給予模型組0.2 ml生理鹽水，肺抑瘤膏低劑量組予0.2 ml/d生理鹽水稀釋1倍的肺抑瘤膏，肺抑瘤膏中劑量組、順鉑加肺抑瘤膏中劑量組予0.2 ml/d肺抑瘤膏，肺抑瘤膏高劑量組予0.4 ml/d肺抑瘤膏，連續灌胃3 w。順鉑組、順鉑加肺抑瘤膏中劑量組予順鉑溶液腹腔注射1.5 mg/(kg·d)，連續注射3 d。

1.4瘤重、腫瘤抑制率 末次灌胃結束后禁食水，次日處死存活模型小鼠，迅速剝離模型小鼠腋下瘤體，用濾紙吸干凈瘤體周圍的血漬后稱瘤重。腫瘤抑制率=(模型組平均瘤重-余各組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100%。

1.5Western印跡法檢測種植瘤組織中PI3K、AKT蛋白表達 種植瘤組織勻漿、裂解提取總蛋白，分光光度計測定蛋白濃度，取蛋白樣品電泳轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫封閉 2 h，PI3K、AKT及β-actin一抗孵育過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗膜，分別用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育 1 h，洗滌后室溫顯影，凝膠成像系統拍照、封存、計算平均相對表達量。

1.6種植瘤組織病理學觀察 剝離模型小鼠種植瘤，迅速固定于10%中性甲醛中，石蠟包埋后切片，常規蘇木素-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察Lewis肺癌種植瘤病理組織形態學變化。

1.7免疫組化法檢測種植瘤組織中mTOR蛋白表達 石蠟切片常規脫蠟至水，乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復，3%過氧化氫(H2O2)去離子水孵育，PBS沖洗，山羊血清工作液封閉室溫孵育，滴加mTOR一抗4℃過夜，PBS沖洗，生物素化二抗工作液室溫孵育，PBS沖洗，辣根酶標記鏈霉卵白素工作液室溫孵育，PBS沖洗，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，自來水充分沖洗，蘇木素輕度復染、脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察，陽性結果為：胞質呈棕黃色顆粒狀。HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統計算每張切片陽性細胞占總細胞的百分比含量。

1.8統計學方法 采用 SPSS17.0軟件，符合正態分布的，采用方差分析；不符合正態分布的，采用非參數檢驗。

2 結 果

2.1動物一般情況 肺抑瘤膏高劑量組意外死亡2只，順鉑加肺抑瘤膏中劑量組死亡1只，解剖后發現死因均為灌胃誤入氣管。

2.2種植成功率 各組接種Lewis肺癌細胞懸液后，1 w內小鼠腋下均可觸及腫瘤硬結，用精度為0.01 mm的游標卡尺測量、計算，結果顯示瘤體體積均可達到100 mm3左右。種植成功率為100%。

2.3各組瘤重、抑瘤率比較 各劑量肺抑瘤膏組Lewis肺癌模型小鼠種植瘤瘤重均較模型組降低，肺抑瘤膏低劑量組、肺抑瘤膏中劑量組、肺抑瘤膏高劑量組隨著肺抑瘤膏濃度的增加其抑瘤率越來越高(P<0.05)。見表1。

表1 各組Lewis肺癌種植瘤瘤重、抑瘤率、PI3K、AKT及mTOR表達

與模型組比較：1)P<0.05；與肺抑瘤膏低劑量組比較：2)P<0.05；與肺抑瘤膏中劑量組比較：3)P<0.05；與肺抑瘤膏高劑量組比較：4)P<0.05；與順鉑組比較：5)P<0.05

2.4各組種植瘤組織病理比較 各組Lewis肺癌模型小鼠種植瘤細胞未見腺體結構，細胞異型性大，屬于低分化癌。肺抑瘤膏中劑量組、肺抑瘤膏高劑量組、順鉑組、順鉑加肺抑瘤膏中劑量組均可見壞死腫瘤細胞。見圖1。

2.5各組mTOR蛋白表達比較 模型組mTOR表達量最高，除順鉑組外，與其他4組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。肺抑瘤膏低劑量組種植瘤mTOR表達，與肺抑瘤膏中劑量組、肺抑瘤膏高劑量組、順鉑組、順鉑加肺抑瘤膏中劑量組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；肺抑瘤膏中劑量組mTOR表達與肺抑瘤膏高劑量組、順鉑組、順鉑加肺抑瘤膏中劑量組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；肺抑瘤膏高劑量組mTOR表達與順鉑組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。順鉑加肺抑瘤膏中劑量組mTOR表達顯著低于順鉑組(P<0.05)。見表1、圖2。

圖2 各組Lewis模型小鼠種植瘤mTOR表達(×400)

2.6各組PI3K、AKT蛋白表達的比較 模型組PI3K、AKT表達量最高，與肺抑瘤膏中劑量組、肺抑瘤膏高劑量組、順鉑加肺抑瘤膏中劑量組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。各組藥物干預均可降低種植瘤PI3K、AKT表達，但肺抑瘤膏低劑量組及順鉑組PI3K、AKT表達量與模型組差異無統計學意義(P>0.05)。肺抑瘤膏低劑量組PI3K、AKT表達與肺抑瘤膏中劑量組、肺抑瘤膏高劑量組比較差異均有統計學意義(P<0.05)；肺抑瘤膏中劑量組PI3K、AKT表達與順鉑組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；肺抑瘤膏高劑量組PI3K、AKT表達，與順鉑組及順鉑加肺抑瘤膏中劑量組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖3、圖4。

1～6:模型組、肺抑瘤膏低劑量組、肺抑瘤膏中劑量組、肺抑瘤膏高劑量組、順鉑組、順鉑加肺抑瘤膏中劑量組；圖4同圖3 各組PI3K蛋白表達

圖4 各組AKT蛋白表達

3 討 論

PI3K/AKT信號通路可激活磷酸化mTOR及下游的p70S6K和真核轉錄起始因子4Z結合蛋白(4E-BPI)的磷酸化而抑制細胞凋亡；上調細胞周期素、細胞周期依賴性蛋白激酶等的翻譯，促進周期運行，加速腫瘤細胞增殖和分化；促進血管內皮生長因子(VEGF)的表達，增加腫瘤細胞血管生成等〔13，14〕。研究〔15〕發現補中益氣湯通過抑制A549/DDP 細胞中PI3K的基因，降低AKT磷酸化，使下游因子如Bad、核因子(NF)-κb表達減少及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-9表達增多，進而促進A549/DDP細胞的凋亡。研究〔16〕發現肺巖寧方聯合吉非替尼可顯著抑制H1975肺癌小鼠移植瘤的生長，促進腫瘤細胞凋亡，顯著下調p-表皮生長因子受體(EGFR)、p-AKT、p-mTOR水平。其作用機制可能與阻斷PI3K/AKT信號通路有關。通過以上文獻研究發現，中藥可抑制腫瘤細胞PI3K/AKT信號通路蛋白表達，抑制細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡，提示中藥肺抑瘤膏可能通過抑制PI3K/AKT信號通路發揮抑瘤作用，本實驗從蛋白層面探討肺抑瘤膏抑制Lewis肺癌模型小鼠種植瘤生長可能的作用機制。

本實驗結果提示低、中、高劑量肺抑瘤膏均可減小Lewis肺癌模型小鼠種植瘤瘤重，且隨肺抑瘤膏劑量的增加抑瘤率逐漸遞增，說明肺抑瘤膏能抑制Lewis肺癌種植瘤生長且與用藥劑量相關。PI3K/AKT信號通路蛋白檢測結果提示不同劑量肺抑瘤膏均可降低Lewis肺癌模型小鼠種植瘤PI3K、AKT、mTOR蛋白的表達，說明肺抑瘤膏可抑制PI3K/AKT信號通路蛋白表達。順鉑對PI3K/AKT信號通路蛋白表達影響不明顯，可能與順鉑作用于腫瘤細胞后影響了腫瘤細胞內多種信號通路及各信號通路間交叉級聯有關，其具體作用機制尚待進一步研究。