銀杏葉提取物(EGb761)對大鼠急性創(chuàng)傷性腦水腫的影響

亢璐 楊智航

(沈陽醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110034)

近年來由交通事故及其他意外造成的創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)日漸增多，其致死率和致殘率居高不下，已成為一個嚴重的全球性公共衛(wèi)生問題〔1〕。TBI引起血腦屏障結(jié)構(gòu)損傷和功能失調(diào)后，血液中的成分進入腦組織，形成腦水腫，使顱內(nèi)壓升高，嚴重的可形成腦疝，危及生命。目前臨床治療創(chuàng)傷性腦水腫的藥物，如20%甘露醇，雖可重復(fù)使用，但有反彈現(xiàn)象，且長期大量使用可造成低鈉血癥和血尿；速尿的利尿作用迅速、強大，但易導(dǎo)致水和電解質(zhì)紊亂；復(fù)方甘油適用于心、腎功能不全的腦水腫患者，但其作用卻遠不如甘露醇直接、有效，這些常用藥物的不足之處需要尋找更好的藥物替代。研究表明在腦損傷時，氧自由基在腦組織中大量增加，自由基使細胞膜系統(tǒng)受損，血腦屏障損害，從而引起腦水腫〔2〕，而銀杏葉提取物(EGb761)是一種高效氧自由基清除劑，具有抗氧化作用，耐受良好，對人體安全〔3〕。本研究通過給予創(chuàng)傷后大鼠不同劑量EGb761，旨在探討其對大鼠急性創(chuàng)傷性腦水腫的影響及潛在機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物及分組 健康成年SD大鼠60只，雌雄不限，體重200～250 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號:SCXK(遼)2015-0001。采用隨機單位設(shè)計法將SD大鼠分為:假手術(shù)(A)組、創(chuàng)傷+等劑量生理鹽水(B)組、創(chuàng)傷+低劑量(25 mg/kg)EGb761(C)組、創(chuàng)傷+高劑量(50 mg/kg)EGb761(D)組。每組大鼠15只，其中6只做干濕重法，3只做蘇木素-伊紅(HE)染色及二氫乙錠(DHE)染色，6只做Western印跡檢測。

1.2主要試劑 EGb761注射液(臺灣濟生化學(xué)制藥廠股份有限公司)；水通道蛋白(AQP)4多克隆抗體(武漢云克隆科技股份有限公司)；β-actin單克隆抗體(美國Proteintech公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒和十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)配制試劑盒(上海碧云天公司)；HE染色試劑盒(北京索萊寶公司)；DHE(美國Sigma公司)。

1.3實驗方法

1.3.1顱腦創(chuàng)傷動物模型的建立 根據(jù)Feeney自由落體致傷法建立急性顱腦創(chuàng)傷模型。動物稱重后，經(jīng)10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉，頭部固定于腦立體定位儀上，備皮，消毒后沿正中線切開頭皮并剝離骨膜，暴露右頂骨，以冠狀縫后3 mm，中線右旁3 mm處為圓心，開一直徑5 mm骨窗，保證硬腦膜完整，將直徑5 mm金屬墊片置于骨窗，撞擊桿垂直置于上方，40 g重錘，25 cm高處，自由落體，撞擊金屬墊片，致使大鼠顱腦損傷。打擊完成后，用骨蠟封閉骨窗，涂抹青霉素，縫合頭皮。A組切開頭皮，只造骨窗，不做打擊。

1.3.2EGb761給藥方法 EGb761注射液，每支(5 ml)含有EGb761 17.5 mg，其中銀杏黃酮苷4.2 mg。該藥物人的臨床劑量為1～2 mg/kg，即大鼠的等效劑量為6.3～12.6 mg/kg，大鼠的用量一般取人用量的6～8倍為有效量。造模后，C組和D組，在創(chuàng)傷1 h后，通過腹腔注射分別給予EGb761注射液25 mg/kg和50 mg/kg；A組和B組大鼠在相應(yīng)時間點，腹腔給予相同劑量生理鹽水。

1.3.3干濕重法測大鼠腦組織含水量 大鼠腦創(chuàng)傷后24 h，在麻醉下斷頭取腦，分離損傷側(cè)及未損傷側(cè)腦組織，將其精確稱重即為濕重(Ww)，在100℃烤箱內(nèi)烤24 h至恒重，稱干重(Dw)，按Elliott公式計算腦組織含水量，即腦組織含水量(%)=(Ww-Dw)/Ww×100%。

1.3.4腦組織切片的制備及HE染色 4%多聚甲醛灌流后，提取大鼠損傷側(cè)腦組織浸入4℃的4%多聚甲醛中固定72 h。取損傷區(qū)域直徑約為5 mm腦組織制成石蠟切片。切片經(jīng)脫蠟水化后，進行HE染色，然后脫水透明、封片，在顯微鏡下觀察。

1.3.5DHE染色實驗 石蠟切片經(jīng)烤片及脫蠟后，DHE熒光探針用二甲基亞砜(DMSO)溶解，制成10 μmol/L的溶液，每個組織加入50～100 μl稀釋液，4℃過夜，去除DHE熒光探針稀釋液，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，各5 min，滴加抗熒光淬滅封片劑封片，通過共聚焦顯微鏡觀察DHE熒光變化。

1.3.6Western印跡檢測AQP4表達水平 麻醉后斷頭，取損傷灶周圍約100 mg腦組織研磨勻漿，提取蛋白，并測定蛋白含量。各樣本等量總蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜后進行封閉；加入AQP4特異性抗體(1∶200)，4℃過夜；二抗稀釋液(1∶2 000)室溫下孵育2 h，最后使用Omega Lum C 進行電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影，Image J軟件對實驗結(jié)果進行分析。以AQP4條帶累積光密度值與β-actin條帶累積光密度值之比表示AQP4的表達水平。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1干濕重法測定腦含水量 創(chuàng)傷所引起的損傷側(cè)腦水腫程度在24 h后明顯增加，與A組〔(78.48±0.32)%〕相比，B組〔(82.43±0.34)%〕腦含水量明顯升高(P<0.05)；C組〔(79.11±0.15)%〕和D組〔(79.37±0.12)%〕，腦含水量雖然高于A組，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。相對于B組，C組與D腦含水量有顯著降低(P<0.05)；C組與D組間腦含水量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2腦組織HE染色 如圖1所示損傷側(cè)腦皮質(zhì)HE染色結(jié)果，A組大腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)完整，細胞形態(tài)正常，著色均勻分布。B組大腦皮質(zhì)水腫區(qū)組織間隙腫脹明顯，著色淺，細胞和血管周圍腔隙增寬。C組和D組細胞和血管周圍腔隙減小，組織間隙腫脹改善，水腫區(qū)縮小。

2.3氧自由基在大腦皮質(zhì)的表達 B組(3.83±0.10)、C組(1.32±0.15)和D組(1.40±0.23)大腦皮質(zhì)中DHE染色的平均氧化熒光密度值高于A組(1.25±0.17)，其中B組與A組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；C組和D組平均氧化熒光密度值較B組顯著降低(P<0.05)，而C組和D組之間無明顯差異(P>0.05)。見圖2。

2.4AQP4在大腦皮質(zhì)的表達 B組(1.01±0.27)、C組(0.48±0.15)和D組(0.52±0.18)AQP4表達水平高于A組(0.46±0.13)，其中B組與A組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與B組相比，C組和D組大鼠腦組織中AQP4的表達水平明顯降低(P<0.05)；而C組和D組大鼠腦組織AQP4表達水平無明顯差異(P>0.05)。見圖3。

圖1 各組大鼠腦皮質(zhì)HE染色結(jié)果(×200)

圖2 各組大鼠腦皮質(zhì)DHE染色結(jié)果(×400)

圖3 Western印跡檢測各組大鼠腦皮質(zhì)中AQP4蛋白表達

3 討 論

急性腦創(chuàng)傷后，氧自由基增多、乳酸性酸中毒、興奮毒性氨基酸、鈣離子超載等因素使腦細胞能量代謝失衡，離子濃度和滲透壓升高，引起創(chuàng)傷性腦水腫〔4〕；在1 h內(nèi)開始，持續(xù)2～24 h，以星形膠質(zhì)細胞受累為主〔5〕，這與本研究結(jié)果相同，損傷灶周圍組織間隙腫脹明顯。本研究結(jié)果提示EGb761能有效減緩腦水腫的發(fā)生，25 mg/kg和50 mg/kg的EGb761療效無差異，25 mg/kg是更適劑量。

神經(jīng)細胞和腦微血管內(nèi)皮細胞既是氧自由基的產(chǎn)生部位，又是其受累最為嚴重的部位〔6〕。氧自由基增多使神經(jīng)細胞膜上鈉泵、鈣泵、細胞色素氧化酶等重要的脂質(zhì)依賴酶失活，膜流動性和通透性增加；Ca2+大量內(nèi)流及興奮毒性氨基酸釋放，引起神經(jīng)細胞和磷脂代謝紊亂，導(dǎo)致嚴重的細胞毒性水腫〔7,8〕。EGb761是德國Schwabe公司生產(chǎn)的銀杏標準提取物，其主要活性成分是黃酮類和萜類內(nèi)酯類。該藥物耐受良好，可見胃腸道不適、頭痛、血壓降低、過敏反應(yīng)等現(xiàn)象，一般不需特殊處理即可自行緩解。長期靜脈注射時，應(yīng)改變注射部位以減少靜脈炎的發(fā)生。根據(jù)藥物說明該藥物嚴禁混合使用，謹慎聯(lián)合用藥。銀杏葉黃酮可通過調(diào)節(jié)氧自由基反應(yīng)酶的活性，減少氧自由基產(chǎn)生，抑制細胞膜的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護腦細胞膜〔9,10〕。應(yīng)用EGb761預(yù)處理，可以顯著降低腦缺血誘導(dǎo)的細胞水腫形成和神經(jīng)退化〔11〕。銀杏葉提取物可通過直接清除自由基或間接抑制自由基的形成而發(fā)揮抗炎作用，減輕海馬神經(jīng)元損傷〔12〕。本研究結(jié)果提示腦含水量降低與EGb761清除腦損傷灶氧自由基有關(guān)。AQP4主要表達在膠質(zhì)細胞足突、膠質(zhì)界膜及室管膜中，其兼有水運輸平衡及滲透壓感受器的雙重功能〔13〕。創(chuàng)傷后大鼠腦組織表現(xiàn)為細胞毒性水腫時，AQP4表達上調(diào)，而AQP4的上調(diào)又將進一步促使腦水腫加重，提示AQP4是導(dǎo)致細胞毒性腦水腫關(guān)鍵因素〔14〕。本研究結(jié)果顯示EGb761干預(yù)后，腦損傷灶A(yù)QP4表達水平降低，提示AQP4可能是EGb761緩解創(chuàng)傷后腦水腫的作用靶點。

綜上所述，EGb761可通過清除氧自由基，降低AQP4表達，改善腦細胞內(nèi)外穩(wěn)態(tài)失衡，這為緩解創(chuàng)傷引起的腦水腫，減少毒副作用，提供新的思路。