miR-145抑制NF-κB p65表達促進ROS產生誘導卵巢癌細胞凋亡的機制

劉玙平 馮秋霞 王翠娜 王運霞

(1河南衛生干部學院婦產科，河南 鄭州 450007；2河南省人口和計劃生育科學技術研究院婦產科；3河南省人民醫院婦產科)

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤，其死亡率和發病率分別居婦科惡性腫瘤第1位和第3位〔1〕。由于卵巢癌發病隱匿，早期癥狀不明顯，超過70%的患者就診時已屬晚期，難以治愈，5年存活率僅40%〔2，3〕。手術治療、放療、化療是卵巢癌的主要治療方式，但其存在的各種毒副作用嚴重影響其治療效果；生物治療、分子靶向治療、免疫治療等治療方法也給中晚期卵巢癌患者的治療提供了更多選擇〔4，5〕。微小RNA(miRNA)廣泛存在于真核生物中，能調控多種下游靶基因參與細胞分化、細胞增殖、胚胎發育等生物過程〔6〕。miRNA失調可促進或抑制多種癌癥，其在惡性腫瘤領域的研究受到了廣泛關注〔7〕。研究〔8，9〕表明，miR-148在肝癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中異常表達，并調節癌細胞凋亡、分化、代謝等過程；而miR-145已被證實在卵巢癌組織及血清中呈低表達〔10〕。為研究miR-145對卵巢癌細胞凋亡的影響及作用機制，本文檢測了過表達miR-145后卵巢癌細胞凋亡率及其相關因子水平，以期為卵巢癌的早期診斷及治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取2016年3月至2018年5月就診于河南省人民醫院并經病理科確診為卵巢癌的患者共46例，年齡31～79歲。收集所有患者經手術切除的卵巢癌組織及相應的癌旁組織(距離病灶≥2 cm)并立即存放于液氮，帶回后儲存于-80℃冰箱備用；所有患者術前未進行放療、化療等其他治療并簽署知情同意書，本實驗經醫學倫理委員會審批同意。

1.2材料 OVCAR3細胞(批號：HTB-161)購自ATCC；胎牛血清(批號：SH41288)、RPMI1640培養液(批號：SH30807)購自美國Gibco-BRL公司；兔抗人Bax多克隆抗體(批號：22160002)購自上海煊翎生物科技有限公司；兔抗人Bcl-2多克隆抗體(批號：PAB19877)、兔抗人含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3 多克隆抗體(批號：ABP52935)、兔抗人核因子(NF)-κB p65多克隆抗體(批號：ABP51955)購自武漢艾美捷科技有限公司；兔抗人β-actin多克隆抗體(批號：XFC1655)購自上海信帆生物科技有限公司；NF-κB抑制劑(PDTC，批號：S1809)、腫瘤壞死因子(TNF)-α(批號：P5318)、總超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒(批號：S0101)、脂質氧化產物丙二醛(MDA)檢測試劑盒(批號：S0131)、活性氧(ROS)檢測試劑盒(批號：S0033)購自上海碧云天生物科技有限公司；Trizol試劑(批號：15596)、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(批號：PC0020)、聚偏氟乙烯(PVDF)膜(批號：BSP0161)、RIPA裂解液(批號：R0020)、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(批號：D0010)、電化學發光(ECL)液(批號：PE0030)購自北京Solarbio公司；Lipofectamine 2000轉染試劑(批號：11668027)購自美國Invitrogen公司；TaKaRa反轉錄試劑盒(批號：RR047A)、TaKaRa實時熒光定量試劑盒(批號：RR820A)購自寶生物工程(大連)有限公司；膜聯蛋白(Annexin)V-FITC凋亡檢測試劑盒(批號：170207)購自美國Coulter公司；酶標儀購自Thermo公司；細胞培養箱購自美國Thermo公司；NanoDrop微量核酸測定儀購自上海創萌生物科技有限公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.3細胞培養與分組 使用含10 %胎牛血清的RPMI1640培養基于37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養OVCAR3細胞。待細胞生長至融合度約50%時，將細胞分組，按照LipofectamineTM2000轉染試劑說明書進行轉染。分別轉染模擬物(mimic)對照(control)、miR-145 mimics、抑制劑(inhibitor)control、miR-145 inhibitor至OVCAR3細胞并依次標記為miR-con組、miR-145組、anti-miR-con組、anti-miR-145組。將OVCAR3細胞重懸并調整細胞懸液濃度為1×106個/ml，接種至96孔板，設置ddH2O組(未添加PDTC)和PDTC組(含終濃度100 μmol/L的PDTC)，繼續培養12 h；轉染miR-145 mimics的細胞使用含終濃度為10 mg/L TNF-α繼續培養12 h并標記為miR-145+ TNF-α組。

1.4RT-qPCR 取適量卵巢癌及癌旁組織，miR-con組和miR-145組細胞，充分研磨，加入Trizol試劑提取總RNA。使用NanoDrop微量核酸測定儀和凝膠電泳系統檢測RNA濃度和質量，分別使用TaKaRa反轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒將RNA反轉錄為cDNA并配制反應體系。以β-actin為內參進行PCR擴增，每個樣品重復3次。β-actin引物：上游：5′-TGGATCAGCAAGCAGGAGTA-3′，下游：5′-TCGGCCACATTGTGAACTTT-3′；miR-145引物：上游：5′-ACACTCCAGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGA-3′，下游：5′-TGGTGTCGTGGACTCG-3′；miR-145相對表達量計算采用F=2-△△Ct法。

1.5Western印跡 收集對數生長期的miR-con組、miR-145組、anti-miR-con組和anti-miR-145組細胞，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液于冰上裂解，4℃，8 459.1 r/min離心20 min，取上清。取適量蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，電泳結束后將蛋白樣品電轉至PVDF膜上，5 %脫脂奶粉TBST液室溫封閉1 h；分別加入兔抗人Bax多克隆抗體(1∶5 000)、兔抗人Bcl-2多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人Caspase-3多克隆抗體(1∶500)、兔抗人p65多克隆抗體(1：1 000)、兔抗人β-actin多克隆抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜；洗膜后加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗室溫孵育2 h；TBST洗膜，ECL試劑盒顯示條帶。以β-actin為內參，實驗重復3次。

1.6雙熒光素酶報告基因實驗 收集OVCAR3細胞，按照LipofectamineTM2000轉染試劑說明書將p65 3′-UTR野生型(Wt)質粒載體(含p65 3′-UTR片段)或突變型(Mut)質粒載體(不含p65 3′-UTR片段)分別與mimic control和miR-145 mimics共轉染，常規培養24 h。裂解后4℃，8 459.1 r/min離心10 min收集上清液，檢測細胞中熒光素酶活性。相對熒光強度=螢火蟲熒光強度/海腎熒光強度。

1.7ROS、MDA、SOD水平檢測 轉染后的miR-con組、miR-145組、ddH2O組、PDTC組和miR-145+ TNF-α組細胞去除上層培養液，以無血清培養液稀釋雙氫-乙酰乙酸二氯熒光黃(DCFH-DA)加入使其終濃度為10 μmol/L，加入到各組細胞中，室溫避光孵育30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌以去除未進入細胞的DCFH-DA。使用酶標儀在激發波長488 nm和發射波長525 nm下檢測細胞二氯熒光黃(DCF)熒光強度，反映ROS生成水平。

各組細胞于冰上裂解，離心收集上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。加入0.2 ml MDA檢測工作液，混勻，沸水浴15 min，冷卻至室溫后酶標儀檢測450 nm處吸光度，計算MDA含量；蛋白上清液中加入酶工作液，37 ℃孵育30 min，酶標儀檢測450 nm處吸光度，計算SOD活力。

1.8細胞凋亡檢測 取轉染后的miR-con組、miR-145組、ddH2O組、PDTC組和miR-145+TNF-α組細胞，胰酶消化后4℃、1 337.5 r/min離心收集。按照Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒說明書分別加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.9統計學分析 使用SPSS22.0 進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1miR-145在卵巢癌組織中低表達 miR-145在卵巢癌組織中表達水平明顯低于癌旁組織(0.34±0.16 vs 1.00±0.23,P<0.05)。

2.2過表達miR-145誘導OVCAR3細胞凋亡 與miR-con組比較，miR-145組細胞上清液中ROS和MDA水平顯著升高(P<0.05)，SOD水平顯著降低(P<0.05)；miR-145組細胞凋亡率明顯增加(P<0.05)，Bax蛋白表達顯著上調，Bcl-2蛋白表達顯著下調，Bcl-2/Bax比值明顯降低(P<0.05)，Caspase-3蛋白表達顯著上調(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 過表達miR-145對OVCAR3細胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達的影響

表1 OVCAR3細胞中miR-145高表達對細胞凋亡的影響

2.3miR-145靶向調控p65蛋白表達 通過Targetscan在線預測發現，p65 3′-UTR上存在miR-145的結合位點(圖2)，表明p65可能是miR-145的潛在靶基因；miR-145組p65 3′-UTR Wt質粒共轉染后熒光素酶活性明顯低于miR-con組(P<0.05)，而與p65 3′-UTR Mut粒共轉染后熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)，見表2；miR-con組、miR-145組、anti-miR-con組、anti-miR-145組p65蛋白表達分別為：(0.99±0.03)、(0.46±0.04)、(1.03±0.05)、(1.54±0.06)。在OVCAR3細胞中過表達miR-145，p65蛋白表達下調(P<0.05)，抑制miR-145則p65蛋白表達顯著上調(P<0.05)。見圖3。

圖2 miR-145與p65互補序列

表2 雙熒光素酶報告基因實驗

2.4抑制NF-κB信號通路促進ROS產生并誘導OVCAR3細胞凋亡 對比ddH2O組，PDTC組細胞上清液中ROS和MDA水平顯著升高(P<0.05)，SOD水平顯著降低(P<0.05)；細胞凋亡率顯著增大(P<0.05)。見表3。

1～4:miR-con組、miR-145組、anti-miR-con組、anti-miR-145組圖3 各組細胞中p65蛋白表達

表3 NF-κB信號通路抑制劑對卵巢癌ROS產生和細胞凋亡的影響

2.5miR-145下調NF-κB p65產生ROS誘導OVCAR3細胞凋亡 過表達miR-145上調OVCAR3細胞上清液中ROS和MDA水平(P<0.05)，并顯著降低SOD水平(P<0.05)，細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；miR-145+TNF-α組細胞上清液中ROS和MDA水平及細胞凋亡率較miR-145組顯著降低(P<0.05)，SOD水平較miR-145組顯著升高(P<0.05)。見表4。

表4 NF-κB激活劑對卵巢癌細胞ROS和凋亡的影響

與miR-con組相比：1)P<0.05；與miR-145組相比：2)P<0.05

3 討 論

miRNA是內源性非編碼RNA，是轉錄后水平基因表達的關鍵調節分子，其調節方式主要通過與靶mRNA 3′-UTR特異性結合〔11〕。miRNA與多種疾病的發生發展密切相關，多種miRNA可作為癌癥診斷的標志物，通過多種途徑調節腫瘤轉移、血管生成并改善患者預后〔12，13〕。其中，miR-145在食管鱗狀細胞癌、三陰性乳腺癌等腫瘤組織中呈低表達，并且能夠通過調節細胞周期、NF-κB信號傳導途徑抑制癌細胞增殖、遷移和侵襲，誘導細胞凋亡，發揮腫瘤抑制作用〔14，15〕。而Zhang等〔16〕分析發現：多種miRNA分子在卵巢癌組織中異常表達，其中miR-145在卵巢癌組織中表達下調。本研究結果與上述結論〔16〕一致。NF-κB主要分布在細胞質中，能夠與B細胞免疫球蛋白κ親鏈基因增強子特異性結合，由p50、p52、p65、cRel、RelB 5種蛋白組成，是介導腫瘤和炎癥發生的主要內在途徑〔17〕。NF-κB是具有多向性調節作用的轉錄因子，其活化后減少癌細胞凋亡相關蛋白表達并誘導產生抗凋亡蛋白，從而抑制腫瘤細胞凋亡〔18〕。p65是分布和作用范圍廣泛的NF-κB因子之一，有研究〔19〕表明：沉默NF-κB p65 可上調Bax蛋白表達并抑制Bcl-2蛋白表達，從而調節細胞凋亡。Caspase-3是執行細胞凋亡的主要酶類，激活Caspase-3可誘導細胞凋亡；并通過p65調節NF-κB活性〔20，21〕。通過干擾p65可激活Caspase-3，從而誘導細胞凋亡〔22〕。ROS水平過高可導致蛋白變性、細胞膜脂質過氧化及DNA損傷；MDA由細胞膜中不飽和脂肪酸與氧自由基發生脂質過氧化生成；SOD是生物體內天然抗氧化酶；細胞內ROS水平失衡可激活細胞凋亡途徑，誘導細胞凋亡〔23，24〕。

綜上所述，在卵巢癌組織中，miR-145表達下調，過表達miR-145可通過上調ROS水平并抑制NF-κB p65蛋白表達從而誘導卵巢癌細胞凋亡。這一研究結果為卵巢癌的早期診斷及臨床治療提供理論基礎，有可能為卵巢癌的治療提供新靶點。