骨保護素基因修飾的骨髓間充質干細胞治療大鼠骨質疏松

柏小金 黃文良 柏帆 鄭強 向柄彥

(遵義市第一人民醫院 遵義醫科大學第三附屬醫院骨科，貴州 遵義 563000)

骨質疏松(OP)在絕經后女性中患病率顯著增加〔1，2〕，嚴重影響中老年人的身體健康和生活質量〔3～6〕。骨保護素(OPG)，又稱護骨素、破骨細胞生成抑制因子，屬于腫瘤壞死因子超家族成員，主要由成骨細胞和骨髓基質細胞合成、分泌〔7〕。OPG是細胞核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)的天然阻滯受體，可競爭性的抑制其與細胞核因子-κB受體活化因子(RANK) 的結合〔8～10〕，進而抑制破骨細胞的增殖活化〔11〕，并抑制成骨細胞對破骨細胞的激活功能和破骨細胞的骨吸收活性〔12，13〕，以減少骨吸收，增加骨密度，此外，OPG還能促進破骨細胞的凋亡〔14〕。骨髓間充質干細胞(BMSCs)來源于骨髓，取材簡便，易于分離及培養，可分泌多種細胞生長因子，具有成骨、成軟骨等多向分化能力，此外，BMSCs具有低免疫原性的特性，可在體外增殖分化，是細胞移植、再生修復及基因治療等方面的理想種子細胞〔15，16〕。本實驗擬采用綠色熒光蛋白(GFP)標記的攜帶OPG基因的慢病毒(LV)載體(LV-OPG-GFP)感染SD大鼠BMSCs，構建成OPG基因修飾的BMSCs(LV-OPG-GFP-BMSCs)，并將其通過尾靜脈注射至去卵巢SD大鼠骨質疏松模型體內，通過全身“給藥”的方式，觀察其治療去卵巢SD大鼠骨質疏松的效果，以期為骨質疏松的治療提供一定的實驗及理論依據。

1 材料及方法

1.1主要實驗動物、材料及試劑 LV-OPG-GFP慢病毒重組載體(上海吉凱生物)；健康雌性SD大鼠〔許可證號：SCXK(渝)2012-0005〕，3月齡，第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心提供；胎牛血清、DMEM/F12(Gibco)；胰蛋白酶、青鏈霉素(Hyclone)；大鼠骨堿性磷酸酶(B-ALP)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、大鼠Ⅰ型膠原C端肽(CTX-1)ELISA試劑盒(武漢華美)；RT-PCR 引物及試劑(Takara)。

1.2主要實驗儀器 雙能X線骨密度測量儀(Siemens)；全自動生化分析儀、低溫離心機(Beckman)；倒置熒光顯微鏡(Olympus)；CO2培養箱(Panasonic)；快速梯度PCR儀、凝膠成像系統(Bio-Rad)；純水制備系統(Millipore)。

1.3BMSCs分離及培養 選取健康雌性SD大鼠1只，頸椎脫臼法處死，無菌條件下取大鼠股骨和脛骨，無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，徹底清除骨表面的軟組織，咬骨鉗咬除股骨和脛骨兩端，用DMEM/F12培養基反復沖洗髓腔至發白，反復吹打細胞懸液后，200目細胞篩網過濾，收取過篩細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，去上清液，用DMEM/F12完全培養基重懸后，以1.0×104個/ml的密度接種于培養瓶內，置于5% CO2、37℃細胞培養箱中培養，48 h半換液，72 h全換液，以后每隔2 d換液1次。每天在倒置顯微鏡下觀察并記錄細胞的生長情況，當細胞長至瓶底面積80%左右時，按照1∶3的比例進行傳代培養。

1.4慢病毒重組載體LV-OPG-GFP感染BMSCs 選用第3代BMSCs，胰酶消化后重懸，進行細胞計數后，按5×104個/ml的細胞密度接種在6孔板中，每孔2 ml，置于細胞培養箱中培養24 h后，更換2 ml新的培養液。分別設置實驗組(LV-OPG-GFP)、陰性對照組(LV)及空白對照組(不加任何轉染試劑)。加入 10 mg/ml 聚凝胺(Polybrene)2 μl，混勻后放入細胞培養箱中培養1 h。期間，從-80℃冰箱取出病毒液，放置于4℃冰箱融化，完全融化后，從細胞培養箱中取出6孔板放入生物安全柜內進行轉染。本研究前期預實驗已證實感染復數(MOI)=80時，細胞轉染率可達80%以上，由此計算所需病毒量，并按分組進行細胞感染，混勻后放入細胞培養箱中培養，24 h后觀察細胞生長狀態，棄掉原培養基，更換完全培養基。72 h后，采用DAPI進行細胞核染色用倒置熒光顯微鏡觀察其綠色熒光的強度，并收集感染后的BMSCs，采用Trizol法提取總RNA，進行PCR后做電泳觀察。

1.5大鼠骨質疏松模型的建立 選取健康雌性SD大鼠40只，隨機分為對照組(8只)與模型組(32只)。 模型組：稱重后,予以適量1%戊巴比妥鈉(10 mg/kg)麻醉，腹部備皮，仰臥位固定于操作臺上，消毒、鋪無菌巾后，逐層切開皮膚、肌肉，進入腹腔，找到子宮，沿子宮向上找到卵巢，結扎并切除卵巢，無菌生理鹽水沖洗后，逐層關閉腹腔，術后3 d予以青霉素鈉預防感染。對照組：術前及術后處理同模型組，不切除卵巢，僅切除等量脂肪組織。造模后大鼠單籠飼養于遵義醫科大學動物中心同一房間、通風良好、室溫25℃、自由攝食、飲水。3個月后采用雙能量X線骨密度檢查法檢測兩組SD大鼠脊柱全長的平均骨密度，確定建模是否成功。

1.6骨質疏松大鼠模型的分組及LV-OPG-GFP-BMSCs尾靜脈注射治療 將成功建立的骨質疏松大鼠模型(32只)，隨機分為A、B、C、D四組，每組8只，采用大鼠尾靜脈注射法〔17〕進行干細胞注射治療。其中A組，注射等量生理鹽水；B組，BMSCs，1×106/kg；C組，注射LV-BMSCs，1×106/kg；D組，注射LV-OPG-GFP-BMSCs，1×106/kg〔18〕。各組飼養條件不變。

1.7LV-OPG-GFP-BMSCs治療大鼠骨質疏松效果評價 在治療后3個月，通過雙能量X線骨密度檢查法檢測A、B、C、D四組大鼠的骨密度。采用1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，通過斷尾法收集A、B、C、D四組及1.5中對照組大鼠外周血液約2 ml，分別用全自動生化分析儀測定血清中鈣、磷含量，并用ELISA 法測定血清中 B-ALP和CTX-1水平，具體操作方法參考各自試劑盒說明書。

1.8統計學處理 使用SPSS18.0軟件進行獨立樣本t檢驗，單因素方差分析。

2 結 果

2.1BMSCs的提取及培養 BMSCs在接種48 h后，基本完全貼壁，貼壁的細胞多呈梭形或多角形，表現出典型的魚群樣或漩渦樣生長，培養5～6 d后細胞逐漸融合并鋪滿瓶底，傳至第3代后，細胞基本呈紡錘形或梭形，形態基本一致，見圖1。

2.2慢病毒重組載體LV-OPG-GFP感染BMSCs效果 將LV-OPG-GFP以MOI=80的病毒量感染BMSCs 72 h后，普通光鏡下觀察發現，實驗組細胞生長狀況可，與陰性對照組相比，未出現明顯的細胞生長緩慢及死亡現象。采用倒置熒光顯微鏡觀察發現，實驗組目的基因OPG已成功轉入BMSCs中并能穩定表達，細胞轉染率可達 80%以上，而陰性對照組因不含GFP基因及其表達產物，故無綠色熒光表達，僅作為細胞生長狀況及熒光空白對照，見圖2。PCR后電泳結果顯示，實驗組OPG mRNA在500～700 bp處出現明顯的條帶，與理論結果相符，而陰性對照組和空白對照組均無表達，提示重組后OPG基因可在BMSCs中穩定表達，見圖3。

圖1 SD大鼠第3代BMSCs形態學觀察(×100)

1：空白組；2：實驗組；3：陰性對照組；4：Marker圖3 PCR檢測三組OPG mRNA的表達

2.3SD大鼠骨質疏松模型構建效果 與對照組〔(0.239±0.005)g/cm2〕相比，模型組骨密度下降明顯〔(0.198±0.013)g/m2,P<0.05〕。說明雙側卵巢切除可以引起大鼠骨質疏松，提示造模成功。

2.4LV-OPG-GFP-BMSCs尾靜脈注射治療大鼠骨質疏松效果評價

2.4.1骨密度檢測結果 尾靜脈注射LV-OPG-GFP-BMSCs治療大鼠骨質疏松3個月后，各組大鼠生長狀況可，未出現死亡及明顯衰弱現象。B、C、D三組骨密度均高于顯著A組(P<0.05)，D組骨密度顯著高于B、C組(P<0.05)，說明通過尾靜脈注射LV-OPG-GFP-BMSCs治療，可大幅度的增高骨質疏松大鼠的骨密度，起到治療作用，但顯著低于正常組(P<0.05)，可能與觀察時間不足有關；B組與C組相比無明顯差異(P>0.05)，將二者與2.3中模型組相比，發現B、C組骨密度未進行性降低(P>0.05)，而A組骨密度則出現進行性降低(P<0.05)，說明BMSCs注入大鼠體內后具有一定的緩解骨質疏松加重的作用，可能與BMSCs在體內持續釋放各種生長因子相關，而LV在大鼠體內不影響骨密度變化，見表1。

表1 治療3個月后各組骨密度、血鈣、血磷、B-ALP及CTX-1水平比較

與A組相比:1)P<0.05；與B組相比:2)P<0.05；與C組相比：3)P<0.05；與D組相比：4)P<0.05

2.4.2血清中鈣、磷檢測結果 血清中鈣、磷檢測結果顯示，A、B、C三組間無明顯差異(P>0.05)，D組及正常組血鈣含量均顯著低于A、B、C三組(P<0.05)，而磷含量均顯著高于A、B、C三組(P<0.05)；D組與正常組相比無明顯差異(P>0.05)，說明建模后大鼠模型血鈣、血磷發生了變化，可能與卵巢切除后破骨細胞的活動增強有關。通過尾靜脈注射LV-OPG-GFP-BMSCs治療后，可使大鼠模型的血鈣明顯降低，而血磷明顯升高，并恢復至正常水平，可能與OPG基因在大鼠體內持續表達，對破骨細胞活性產生抑制，使破骨作用減弱有關，見表2。

2.4.3血清 B-ALP 測定結果 血清B-ALP測定結果顯示，A、B、C三組間無明顯差異(P>0.05)，D組及正常組血清B-ALP水平均顯著低于A、B、C三組(P<0.05)，而D組與正常組相比無明顯差異(P>0.05)。說明A、B、C三組成骨細胞的活性增強，可能是由于大鼠模型的卵巢切除后導致破骨細胞活性增強，反饋性的引起成骨細胞活性也隨之增強，以代償及維持體內鈣磷代謝平衡，此外也說明僅注射BMSCs對成骨細胞的活性無明顯影響；而通過尾靜脈注射LV-OPG-GFP-BMSCs治療后，D組成骨細胞活性明顯下降，基本恢復到正常水平，可能是由于OPG基因在大鼠體內表達，使破骨細胞活性受抑制，成骨細胞活性也隨之反饋性的下降。說明尾靜脈注射LV-OPG-GFP-BMSCs后，對大鼠骨質疏松有一定治療作用，見表2。

2.4.4血清CTX-1測定結果 血清CTX-1測定結果顯示，B、C、D及正常組CTX-1水平均顯著低于A組(P<0.05)，B組及C組無明顯差異(P>0.05)，D組及正常組CTX-1水平顯著均低于B、C組(P<0.05)，但D組CTX-1水平顯著高于正常組(P<0.05)。說明卵巢切除后破骨細胞活性明顯增強，B組、C組注射BMSCs對破骨細胞的性僅能產生輕微抑制，而通過尾靜脈注射LV-OPG-GFP-BMSCs治療后，D組破骨細胞活性明顯下降，基本接近正常水平，可能是由于OPG基因在大鼠體內表達，使破骨細胞活性明顯受抑制，而起到治療骨質疏松的作用，見表2。

3 討 論

骨質疏松嚴重影響患者生活質量，主要累及中老年女性，骨質疏松性疼痛及骨折是導致患者生活質量下降的主要原因。目前臨床上有種類繁多抗骨質疏松的藥物，但在應用過程中存在療程長、副作用明顯及依從性差等缺點〔19〕。隨著基因技術的不斷發展，基因治療作為一種新的治療方法被廣泛研究。OPG基因自1997年被發現以來就備受關注〔20〕，其抑制破骨細胞增殖活化、減少骨吸收、增加骨密度的作用已被研究證實〔21,22〕，目前多數研究者認為OPG/RANKL/RANK信號系統是治療骨質疏松的最相關靶向位點，尤其以OPG/RANKL的變化規律更為重要〔10,23～26〕。BMSCs具有多向分化功能，可分泌多種細胞生長因子，在骨組織再生及修復方面備受關注，研究發現其向成骨分化的多少是骨質疏松發病的重要機制〔27,28〕，因此，將BMSCs作為OPG基因的表達載體可能更有利于骨質疏松的治療。本研究成功提取培養出SD大鼠BMSCs，并用慢病毒重組載體LV-OPG-GFP感染BMSCs構建OPG基因體內表達載體，結果顯示重組后OPG基因可在BMSCs中穩定表達。

大鼠的骨骼變化與人類相近，目前公認的與臨床最相似的絕經后骨質疏松動物模型是采用去勢法構建的去卵巢大鼠模型，因其成功率高、穩定性好，使該種方法得到了廣泛應用〔29,30〕。美國食品與藥物管理局(FDA)和世界衛生組織(WHO)也推薦去卵巢大鼠為研究絕經后骨質疏松的最佳動物模型〔31〕。本研究亦采用此法將雌性SD大鼠雙側卵巢切除，3個月后模型組SD大鼠骨密度下降明顯，說明絕經后SD大鼠骨質疏松模型構建成功。

骨質疏松是全身性的代謝性疾病，表現為全身性的骨量減少，骨密度降低，因此本研究采用尾靜脈注射法將載有OPG基因的BMSCs注入去卵巢SD大鼠骨質疏松模型體內，通過全身“給藥”的方式治療并觀察其效果。

治療3個月后，骨密度檢測結果表明通過尾靜脈注射LV-OPG-GFP-BMSCs治療，可大幅度的增高骨質疏松大鼠的骨密度，起到治療作用，但與正常骨密度相比，仍略顯不足。BMSCs僅具有一定的緩解骨質疏松加重的作用，可能與BMSCs在體內持續釋放各種生長因子相關。血清中鈣、磷、B-ALP 及CTX-1水平的升降變化也說明在尾靜脈注射LV-OPG-GFP-BMSCs治療后，OPG基因在大鼠體內持續表達及BMSCs在體內釋放多種生長因子，二者協同，對破骨細胞活性產生抑制，使破骨作用減弱，導致血鈣下降，血磷升高，基本恢復至正常水平，而CTX-1作為反映破骨細胞活性及骨吸收的特異性蛋白，也隨之下降；B-ALP則是反映成骨細胞活性的特異性蛋白，其降低可能是因為破骨細胞活性減弱時，成骨細胞活性也隨之反饋性的下降，以維持骨代謝平衡。

綜上，尾靜脈注射LV-OPG-GFP-BMSCs治療SD大鼠骨質疏松，未出現明顯的毒副作用，治療效果良好，可為臨床骨質疏松的治療提供一定實驗依據。但本研究僅在整體的角度上對LV-OPG-GFP-BMSCs的短程治療效果進行評價，而對于LV-OPG-GFP-BMSCs在大鼠體內的富集、歸巢、分化、分泌及長期安全性有待進一步研究證實。