鹽酸氫嗎啡酮降低缺血再灌注大鼠心肌損傷

董文理 張郃 廖衛(wèi)寧 程金紅 安寧

(咸寧市中心醫(yī)院麻醉科，湖北 咸寧 437000)

心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是指心肌組織在經(jīng)歷一定時(shí)間的缺血后恢復(fù)血流供應(yīng)，心肌損傷加重的一種現(xiàn)象。其可導(dǎo)致代謝異常、心律失常、心肌舒縮功能障礙等，導(dǎo)致心臟發(fā)生一系列損傷，目前缺血性心臟病已成為世界范圍內(nèi)引起死亡的一個(gè)主要病癥〔1〕。鹽酸氫嗎啡酮是一種新型的強(qiáng)效阿片類鎮(zhèn)痛藥，具有良好的血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性，可同時(shí)保證足夠的心肌氧供應(yīng)，靜脈給藥后5～8 min就能發(fā)揮最大的藥效〔2〕。關(guān)于鹽酸氫嗎啡酮對(duì)心肌缺血后處理的保護(hù)效應(yīng)研究較少，有研究顯示，氫嗎啡酮可減輕大鼠MIRI，其保護(hù)機(jī)制可能與磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)信號(hào)的激活有關(guān)〔3〕。氫嗎啡酮后處理可通過(guò)改善再灌注左室功能、降低心肌損傷相關(guān)酶濃度、增加冠脈流量、降低心肌梗死面積，從而減輕大鼠MIRI，其心肌保護(hù)作用與抑制線粒體膜轉(zhuǎn)運(yùn)孔在灌注初期開(kāi)放有關(guān)〔4〕。本研究旨在探討鹽酸氫嗎啡酮對(duì)MIRI后炎性因子、心肌梗死面積、Toll樣受體(TLR)-4 信號(hào)及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器 鹽酸氫嗎啡酮注射液由湖北宜昌人福藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。2，3，5-氧化三苯基四氮唑(TTC)、烏拉坦、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Sigma；TLR-4、Bcl-2、Bax和酶切caspase3抗體均購(gòu)自美國(guó)CST。蛋白質(zhì)凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-rad。

1.2實(shí)驗(yàn)分組及處理 健康SPF級(jí)雄性成年SD大鼠108只，體重180～220 g，于23℃、50%濕度條件下飼養(yǎng)。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)(S)組、缺血再灌注(I/R)組和鹽酸氫嗎啡酮預(yù)先給藥(H)組，每組36只，其中S組只分離股動(dòng)脈及頸內(nèi)靜脈，不作其他處理。H組在缺血前10 min頸內(nèi)靜脈注射鹽酸氫嗎啡酮注射液0.2 mg/kg。I/R組頸內(nèi)靜脈注射等容量生理鹽水。

1.3肢體I/R致大鼠心肌損傷模型建立 大鼠禁食8 h，不禁飲，腹腔注射25%烏拉坦5 ml/kg麻醉，右頸部開(kāi)口分離頸內(nèi)靜脈，置管建立靜脈輸液系統(tǒng)，接微電腦靜脈微量輸液泵。后肢游離雙側(cè)股動(dòng)脈、股靜脈，動(dòng)脈夾夾閉股動(dòng)脈近端，并用張力帶股鞘下環(huán)扎阻斷側(cè)支循環(huán)。遠(yuǎn)端股動(dòng)脈置管測(cè)壓，血壓為0標(biāo)志缺血成功，肢體缺血2 h，去除動(dòng)脈夾恢復(fù)肢體血供，血壓升高為再灌注成功。

1.4生化指標(biāo)的測(cè)定 于再灌注120 min末隨機(jī)取6只采集動(dòng)脈血樣，4℃，離心10 min，取上清液，-80℃冰箱保存待測(cè)。采用ELISA測(cè)定血清白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-10、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)濃度。步驟見(jiàn)ELISA試劑盒說(shuō)明。

1.5心肌梗死面積測(cè)定 于再灌注120 min末，即實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取下離體灌流的心臟，將心房及動(dòng)脈剪取，保留心室，濾紙吸干稱重，于-30℃冰箱冷凍15 min，取出變硬的心臟，將心室從心尖向心底方向剪成1 mm的薄片，共6片，37℃、避光、1%TTC溶液浸泡15 min，取出薄片，正常區(qū)呈現(xiàn)磚紅色，而梗死區(qū)呈現(xiàn)灰白色，將梗死區(qū)心肌剪下，濾紙吸干稱重。梗死面積(IS)=梗死區(qū)重量/心室重量×100%。

1.6心肌組織中TLR-4、Bcl-2、Bax和酶切caspase3蛋白水平檢測(cè) 于再灌注120 min末取出心肌后，4℃預(yù)冷生理鹽水沖洗，剝?nèi)〖s50 mg心肌組織，放射免疫沉淀(RIPA)裂解液適量提取組織總蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)測(cè)定蛋白濃度，以4∶1比例，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，煮沸變性5 min，取變性蛋白30 μg，每孔道等量，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，分離后的蛋白經(jīng)電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，膜用5%的脫脂奶粉封閉1 h，加TLR-4、Bcl-2、Bax和酶切caspase3抗體，抗體的工作液濃度均為1∶1 000，4℃孵育過(guò)夜，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，洗膜，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，顯影、定影。應(yīng)用Image-Pro Plus軟件分析。以GAPDH為內(nèi)參，以目的條帶與GAPDH條帶灰度值比值為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1血清IL-6、IL-10、SOD和MDA濃度 與S組比較，I/R組IL-6、IL-10和MDA的濃度均明顯升高，SOD濃度明顯降低(P<0.05)；與I/R組比較，H組IL-6和MDA濃度均明顯降低，IL-10和SOD濃度明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2心肌梗死面積 與S組(9.8%±1.7%)比較，I/R組心肌梗死面積(66.1%±5.6%)顯著增加(P<0.05)；與I/R組比較，H組心肌梗死面積(30.4%±3.5%)顯著降低(P<0.05)。

表1 各組血清IL-6、IL-10、SOD和MAD濃度

與S組比較，2)與I/R組比較：P<0.05；表2同

2.3心肌組織TLR-4蛋白表達(dá) 與S組(0.078±0.010)比較，I/R組TLR-4蛋白表達(dá)(0.802±0.075)顯著增加(P<0.05)；與I/R組，H組TLR-4蛋白表達(dá)(0.214±0.018)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組心肌組織TLR-4蛋白表達(dá)

2.4心肌組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 與S組比較，I/R組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，Bax和酶切caspase3的蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與I/R組比較，H組Bcl-2的蛋白表達(dá)顯著升高，Bax和酶切caspase3的蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表2和圖2。

表2 各組Bcl-2、Bax和酶切caspase3蛋白的相對(duì)表達(dá)量

圖2 各組心肌組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討 論

離體心臟試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多種藥物和生物因子具有與藥物預(yù)處理有關(guān)的心肌保護(hù)作用，如異氟烷、胰島素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、粒細(xì)胞集落刺激因子、腺苷受體激動(dòng)劑、他汀類等〔5～7〕。嗎啡等阿片類藥物在動(dòng)物離體心肌缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)中亦顯示出藥物預(yù)處理的心肌保護(hù)作用。以往對(duì)阿片類藥物預(yù)處理的心肌保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究多在細(xì)胞和離體心臟模型水平進(jìn)行，如嗎啡預(yù)處理可通過(guò)調(diào)控miR-133b-5p減輕心肌細(xì)胞缺氧再給氧損傷〔8〕；舒芬太尼后處理可能通過(guò)上調(diào)Bcl-2表達(dá)，下調(diào)Bax表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，從而減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷〔9〕。而在體水平上應(yīng)用阿片類藥物預(yù)處理是否仍具有心肌保護(hù)作用，尚待進(jìn)一步研究。鹽酸氫嗎啡酮是一種新型的強(qiáng)效阿片類鎮(zhèn)痛藥，是否具有心肌缺血后處理的保護(hù)效應(yīng)尚未明確。本研究結(jié)果顯示，鹽酸氫嗎啡酮可提高大鼠MIRI后血清IL-10和SOD濃度，降低IL-6和MDA濃度，降低心肌梗死面積，降低TLR-4 信號(hào)，促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，抑制Bax和酶切caspase3表達(dá)。

心肌炎、心力衰竭、膿毒癥、心臟再灌注損傷等多種心血管疾病均與細(xì)胞因子的釋放有關(guān)〔10〕。IL-6是一種具有多種生物活性的因子，由中性粒細(xì)胞產(chǎn)生，參與免疫調(diào)節(jié)及應(yīng)激反應(yīng)，有研究表明，缺血及再灌注可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生IL-6〔11〕。IL-10是體內(nèi)主要的抗炎因子之一，主要由T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生，可抑制Th1細(xì)胞分泌IL-6、腫瘤壞死因子-α等細(xì)胞因子〔12〕。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是I/R引起心肌損傷的一個(gè)重要機(jī)制，自由基是氧化應(yīng)激造成MIRI的主要參與者，其反應(yīng)程度與SOD和MDA有關(guān)〔13〕。本研究結(jié)果提示，鹽酸氫嗎啡酮可通過(guò)調(diào)節(jié)炎性因子IL-6、IL-10、SOD和MDA濃度減輕MIRI。

TLRs作為一類介導(dǎo)天然免疫反應(yīng)的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體家族，能夠識(shí)別特定類型微生物保守的分子成分，引發(fā)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而導(dǎo)致炎性介質(zhì)釋放，在天然免疫防御中起重要作用，并可最終激活獲得性免疫系統(tǒng)〔14〕。目前已在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)至少有12 種Toll 蛋白，其中TLR-4信號(hào)通路在MIRI中發(fā)揮重要作用，TLR-4突變后能減弱其后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從而減輕MIRI及炎癥反應(yīng)〔15〕。細(xì)胞凋亡又稱為程序性死亡，是心肌梗死早期細(xì)胞死亡的一個(gè)主要形式，最后可導(dǎo)致MIRI。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白，有研究表明，Bcl-2和Bax的實(shí)際濃度在I/R過(guò)程中發(fā)揮保護(hù)或促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用〔16〕。caspase3屬于caspase家族成員，是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的效應(yīng)caspase及凋亡的執(zhí)行者，其活化將使凋亡進(jìn)入不可逆階段〔17〕。川陳皮素后處理可通過(guò)Bcl-2、Bax和caspase3表達(dá)調(diào)節(jié)減輕MIRI細(xì)胞凋亡〔18〕。本研究結(jié)果提示鹽酸氫嗎啡酮對(duì)MIRI心肌細(xì)胞凋亡影響可能與調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax和caspase3表達(dá)有關(guān)。

綜上，鹽酸氫嗎啡酮可通過(guò)對(duì)炎性因子IL-6、IL-10、MDA和SOD，心肌梗死面積，TLR-4 信號(hào)及凋亡相關(guān)的Bcl-2、Bax和酶切caspase3表達(dá)的調(diào)節(jié)，從而對(duì)MIRI起保護(hù)作用。