培哚普利抗絕經后骨質疏松的作用與Wnt信號通路的關系

薛青 王玲玲 鐘奕

(中山大學 1附屬第五醫院老年病科，廣東 珠海 519000；2附屬第七醫院老年病科)

腎素-血管緊張素-醛固酮系統各組分存在于骨組織中，而且調控著骨骼的生長、代謝，血管緊張素轉換酶(ACE)抑制劑(ACEI)類藥物可能有改善骨質疏松的作用〔1〕。在臨床工作中課題組也觀察到培哚普利可降低絕經后骨質疏松伴高血壓患者的骨轉換指標，可改善原發性骨質疏松患者的骨痛癥狀〔2〕；隨之的動物實驗也得出培哚普利可促進維甲酸致骨質疏松大鼠的骨形成，增加大鼠的骨質量，提高骨密度(BMD)，而且其促進骨形成的作用呈劑量依賴性，8 mg/kg的培哚普利作用較為明顯〔3〕。本實驗探討培哚普利對卵巢去勢大鼠Wnts信號通路相關因子的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選用SPF級3月齡SD雌性大鼠50只，體重230～250 g，購自北京維利通華實驗動物技術有限公司，出廠前已按實驗的要求造模(見實驗分組)。全部按SPF級實驗動物管理標準進行飼養和操作。

1.2藥品與主要試劑 培哚普利(施維雅天津制藥有限公司)。戊酸雌二醇(E2)、戊巴比妥鈉(武漢貝爾卡生物醫藥有限公司)；E.Z.N.A.TM脫氧核糖核酸(DNA)/核糖核酸(RNA)/蛋白質分離試劑盒(OMEGA)；PrimeScriptTM一步法實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)試劑盒版本2、RNA干擾劑〔TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司〕；引物和探針(上海輝睿生物科技有限公司)。

1.3主要儀器 小動物電子分析天平(德國Sartorius公司)；雙能X線BMD測定儀(美國Hologic公司)；DSHZ-300型恒溫水浴箱 (中國太倉市科教器材廠)；高速低溫離心機(ALC 公司)；自動生化分析儀(美國Beckman 公司)；RT-qPCR儀(美國ABI公司)；IMS-20全自動雪花制冰機(常熟市雪科電器有限公司)；超低溫冰箱(日本Sanyo公司)。

1.4實驗動物與分組 50只SD大鼠分為3組：正常對照組10只，假手術(Sham)組10只，去卵巢組30只；去卵巢組大鼠摘除雙側卵巢；Sham組大鼠僅切除雙側卵巢周邊脂肪組織；大鼠摘除卵巢4 w后，用3%戊巴比妥鈉溶液1 ml/kg進行腹腔麻醉，采用雙能X線BMD測定儀活體測量大鼠雙側股骨的BMD的變化。 將去卵巢組中的30只大鼠隨機分為3組，分別為卵巢去勢(OVX)組、培哚普利組、E2組各10只。各組大鼠均單籠飼養，自由進食飲水。飼養環境溫度 25℃，12 h明暗交替照明，環境安靜，通風良好。

1.5藥物干預 實驗第5周開始給藥干預，培哚普利組給予培哚普利4 mg/kg灌胃，E2組給予1.2 mg/kg戊酸E2灌胃，正常對照組、Sham組及OVX組大鼠給予相同體積蒸餾水灌胃，1次/d，持續給藥12 w。各組大鼠每周稱體重1次，以便適時調整給藥量。

1.6取材與指標測定 雙側股骨處理：心臟徹底抽血處死所有大鼠，迅速取出處死大鼠的兩側股骨，剔除周圍軟組織后，測量左側股骨BMD，取出右側股骨后立即裝入凍存管中置于液氮中凍存，用于提取RNA。

1.7引物設計與合成 本實驗中所用到的引物序列用Primer3.0軟件設計，經對比分析后委托上海輝睿生物科技有限公司合成。

1.8引物稀釋與保存 引物工作液為10 μmol/L，將儲存液稀釋10倍即成工作液。引物及探針使用前先離心，用RNA酶處理(RNase Free)水溶解，充分震蕩后稀釋至終濃度為10 pmol/μl，分管備用。引物及探針序列見表1。

表1 引物及探針序列

1.9骨組織中總RNA的提取、清洗及溶解

1.9.1從液氮中取出凍存的股骨，研磨至成粉末狀，每50 mg樣品中加入2 ml RNA干擾劑，劇烈搖晃充分混勻，使裂解液均勻分布于細胞表面，平置10 min后將勻漿液轉移到離心管中，室溫靜置5 min，12 000 r/min 4℃離心5 min；向裂解液中加入200 μl氯仿，上下震蕩15 s，待溶液充分乳化后在室溫靜置5 min；12 000 r/min 4℃離心5 min；吸取上清液至另一離心管中加入等體積的冷異丙醇，充分混勻后，室溫靜置10 min，12 000 r/min 4℃離心10 min，棄上清，加入400 μl 75%乙醇，輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，12 000 r/min 4℃離心15 min后棄去乙醇；加入適量的RNace-free水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。

1.9.2RNA濃度測定 紫外分光光度計(Nanodrop 2000)測定 RNA濃度和純度，在電腦上記錄相應編號的濃度及其光密度(OD)260/OD280比值，最后保存數據。

1.9.3RNA質量分析 OD260/OD280比值在1.8～2.0為RNA純度很高，<1.8可能存在蛋白質污染，>2.0說明可能存在異硫氰酸胍等有機溶劑殘留污染。另外取部分 RNA溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，進一步確定RNA的完整性和受污染情況。

1.10RT-qPCR 根據PrimeScriptTM一步法RT-PCR試劑盒要求設定反應體系：將試劑盒中的緩沖液、RNase Free水及引物、探針在室溫下融解，短暫離心后按計算好的劑量依次加入PCR管中，酶混合劑后加，使用完畢立即放回-20℃冰箱中，注意探針在使用過程中始終保持避光；將加入的試劑迅速混勻，并平均分配到96 孔板中，最后加入模板RNA，仔細貼上貼膜。每孔總體積25 μl，每個樣本設3個復管。實驗中每一組樣本均設計陰性對照(NTC)，即在反應中用RNase Free水來代替模板RNA，其他反應體系的種類和上樣體積均不變，從而監測體系是否受到污染；將96孔板進行短暫離心，使所有反應液離開管壁回到底部；將96孔板放入PCR儀中進行PCR 反應，逆轉錄50℃30 min，預變性95℃2 min，變性95℃10 s，退火、延伸55℃40 s，40個循環。反應完成后輸出實驗結果，保存數據；用TaqMan探針法進行相對定量分析，以 β-actin 作為內參基因，2-ΔΔCt計算基因的相對表達量。

1.11統計學分析 采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗、Dunnettt檢驗。

2 結 果

2.1股骨BMD結果 與正常對照組BMD〔(0.067±0.003)g/cm2〕相比，Sham組〔(0.067±0.003)g/cm2〕無明顯變化(P>0.05)；與Sham組相比，OVX 組BMD〔(0.038±0.003)g/cm2〕顯著降低(P<0.01)，降幅為20.19%；與OVX組相比，E2組BMD〔(0.067±0.003)g/cm2〕上升20.60%(P<0.01)；與OVX組相比，培哚普利組BMD〔(0.049±0.002)g/cm2〕有所回升(P<0.05)，升幅為7.40%，回升程度遠不如E2組明顯(P<0.01)。

2.2Wnt3a/LRP5/β-catenin mRNA表達 與Sham組比較，OVX組Wnt3a、LRP5、β-catenin mRNA表達分別下降26.00%(P<0.01)、18.12%(P<0.05)、38.77%(P<0.01)，培哚普利組可上調Wnt3a、LRP5、β-cateni的mRNA表達(P<0.05)，分別比OVX組上調了8.11%、9.37%、18.23%(P<0.05)。E2組明顯上調Wnt3a、LRP5、β-catenin mRNA表達，與OVX組相比，分別上調了27.62%、19.05%及50.30%(P<0.01)，見表2。

表2 股骨Wnt3a、LRP5、β-catenin mRNA表達水平比較

與Sham組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與OVX組比較：3)P<0.05；4)P<0.01

3 討 論

與正常對照組相比，Sham組BMD未見明顯差異，說明手術本身對BMD無明顯影響。OVX組股骨BMD 顯著降低，而給予戊酸E2和培哚普利后，BMD有所升高，這表明E2和培哚普利均可抑制去卵巢導致的大鼠BMD降低，但后者遠不如前者明顯。由于體重的增加對BMD會造成一定的干擾，為排除干擾，本實驗將BMD值除以大鼠處死前的體重再乖以100以校正，校正后的培哚普利組BMD比Sham組高，說明培哚普利可提高去卵巢大鼠的BMD。

臨床研究表明，雌激素治療可增加血管緊張素原、血管緊張素Ⅰ和血管緊張素Ⅱ的循環濃度，降低循環ACE，并改變血漿腎素濃度〔4〕。在雌激素缺乏的動物模型中，卵巢切除術會引起ACE和血管緊張素Ⅱ 1型受體的組織表達上調和血管緊張素Ⅱ2型受體的組織表達降低〔5〕。已有多項人類和小鼠的基因研究和細胞學研究證明，Wnt/β-catenin信號通路在骨骼發育及代謝平衡中起重要作用，包括成骨細胞前體擴增、終末分化、礦化和細胞的凋亡〔6〕。研究發現，成骨細胞持續激活β-catenin可使破骨細胞減少，增加骨量；敲除β-catenin后破骨細胞增加、骨量降低〔7，8〕；而低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)5的缺失，成骨細胞的功能和增殖受阻，骨形成受影響〔9〕；此外，Wnt3a、Wnt4、Wnt5a均可影響破骨細胞的分化〔10〕。本研究顯示，與Sham組相比OVX組大鼠骨組織中Wnt3a、LRP5、β-catenin mRNA表達均下調，在給予雌激素及培哚普利治療后Wnt3a、LRP5、β-catenin mRNA的表達均可上升。近年來研究發現硬骨病基因(SOST)通過結合LRP5、LRP6而抑制了Wnt信號通路的激活，從而抑制了骨形成過程〔11〕；在對糖皮質激素誘導的骨質疏松兔研究中發現培哚普利的服用可下調骨組織中SOST mRNA 的表達〔12〕；此外，研究發現血管緊張素Ⅱ可下調成骨細胞中核結合因子(Cbfa)1，Cbfa1可拮抗SOST的表達〔13〕，培哚普利是否通過抑制血管緊張素Ⅱ的生成增加Cbfa1的表達進而減少SOST，啟動Wnt通路，從而改善骨質疏松，有待進一步研究。

Wnt信號在骨重建、RANKL再生和SOST拮抗等方面均起到重要的調節作用〔14〕，目前該通路上的相關因子及拮抗因子被視為抗骨質疏松藥物研究的新靶點，因此研究藥物在該通路中的作用對抗骨質疏松的研究有重要的意義。此研究對靶向Wnt/SOST通路的ACEI抗絕經后骨質疏松的作用與機制研究提供了一定的研究基礎，有待進一步探索。

由于實驗條件及經費有限，本實驗測量骨密度時未能對大鼠進行全身掃描或用定量CT測定，也未能對大鼠骨結構進行生物力學性能檢測，這對研究藥物的作用來說結果相對片面，另外，用PCR測量相關因子表達時如果增加相應的蛋白免疫印跡技術將更有說服力，這在以后的科研工作中會盡量反省并克服。