磷酸化α-突觸核蛋白在C57BL/6J小鼠邊緣葉與大腸中的增齡性變化及相關性

韓燕銀 朱明慧 孔令東 駱降喜 田順亮 陳敏 劉承偉 于蘭

(1桂林醫學院，廣西 桂林 541004；2菏澤醫學專科學校人體解剖學教研室；3桂林醫學院附屬醫院)

帕金森病(PD)是臨床上常見的一類神經系統變性疾病，也是中老年人最常見的錐體外系疾病。在典型的運動癥狀之前，PD還存在一系列復雜多樣的非運動癥狀，其中消化系統功能紊亂是PD早期最常見的非運動癥狀之一〔1〕。

PD的主要病理學特點是黑質多巴胺神經元變性、缺失及路易小體(LBs)的形成，LBs的主要成分是Alpha-突觸核蛋白(α-syn)〔2〕。α-syn是一種在中樞神經系統突觸前及核周表達的可溶性蛋白質，與PD的發病機制和相關功能障礙密切相關，不僅使記憶減退、運動遲緩，而且α-syn聚集還可導致腸神經系統(ENS)異常，而ENS異常與消化功能紊亂密切相關〔3，4〕。研究顯示，某些通常被認為病變部位在大腦的退行性疾病，如阿爾茨海默病(AD) 等，在大腦實質神經細胞外會出現淀粉樣蛋白沉淀物即α-syn的聚集，在該患者胃腸道 ENS 中也會出現α-syn不同程度的聚集〔5〕。在PD患者腦內，在某些大腦神經元中出現的LBs也會在腸道神經元中出現，并且消化功能紊亂先于運動障礙發生，由此可見腸道 ENS 可能成為觀察大腦狀況的窗戶〔6，7〕。

α-syn的主要毒性分子形式是寡聚化α-syn(O-α-syn)，在寡聚化發生的過程中，α-syn S129位點磷酸化修飾后更易聚集為寡聚化狀態〔8，9〕。當腦內神經元α-syn 聚集達到一定程度時，其運動狀態會發生改變。隨著年齡的增加，老化成為神經退行性疾病發生的關鍵因素之一〔10〕。大腦邊緣葉是內臟活動的高級中樞，但α-syn在邊緣葉中的聚集程度和在腸神經節中的變化規律尚不清楚。

1 材料與方法

1.1材料 健康C57BL/6J小鼠青年(2個月)、中年(8個月)、老年(24個月)各5只，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(湘)2016-0002。飼養條件：在桂林醫學院SPF級動物中心，小鼠適應環境1 w后，單籠飼養，溫度22～24℃，相對濕度適宜，自由攝食與飲水，自動光控12 h明暗周期。兔抗人磷酸化(P)-α-syn單克隆抗體(Santa Cruz公司，美國)，辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔IgG、生物素化的鼠單克隆抗體(康為世紀標記公司)。

1.2方法

1.2.1動物行為學測試 通過平衡桿實驗、爬桿實驗和曠場實驗觀察不同年齡段小鼠平衡力、肌力、抓力、運動能力和協調能力等行為學的改變。每只小鼠先進行適應性訓練，然后開始正式測試。

1.2.2Western印跡檢測

1.2.2.1組織勻漿的制備 斷頭處死小鼠后，取結腸、直腸一部分及大腦邊緣葉并立即置于液氮中速凍，然后轉移到-80℃冰箱中保存。將結腸、直腸和邊緣葉在加有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液中研磨、裂解，12 000 r/min、4℃離心30 min，取上清，采用2，2-聯喹啉-4,4-二甲酸二鈉(BCA)蛋白質測定試劑盒(Thermo Scientific公司，美國)根據說明書測定蛋白質濃度。

1.2.2.2α-syn水平檢測 BCA定量后的蛋白加入一定體積的上樣緩沖液，使用聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，12.5%分離膠，一抗稀釋濃度分別為β-actin 1∶5 000(冠星宇，北京)、P-α-syn 1∶1 000，二抗稀釋濃度分別為HRP抗鼠IgG 1∶5 000、HRP抗兔IgG 1∶5 000，化學發光試劑(ECL)發光顯影(Thermo Pierce公司，美國)。

1.3統計學方法 使用ImageJ軟件分析Western印跡條帶灰度值，使用SPSS18.0軟件統計，通過GraphPad Prism 6軟件分析數據并繪圖，多組間計量資料比較用方差分析，兩組間比較用獨立樣本t檢驗，相關性用Pearson分析。

2 結 果

2.1行為學結果 隨著年齡的增加，老年組、中年組、青年組小鼠在平衡桿、爬桿、曠場實驗中的表現均有統計學差異。青年組、中年組、老年組小鼠平衡桿和爬桿實驗所用時間逐漸增加，各組間差異顯著(P<0.001)；曠場實驗結果顯示，青年組、中年組、老年組小鼠單位時間內的速度逐漸降低，各組間差異顯著(P<0.001)；行為學測試中，老年組出現輕微的運動遲緩、步態不穩定、反應遲緩等表現。見表1。

表1 各組平衡桿實驗、爬桿實驗所用時間及曠場實驗的速度比較

與青年組比較：1)P<0.01，2)P<0.001

2.2Western印跡檢測結果

2.2.1結腸P-α-syn的表達情況 隨著年齡的增加，小鼠結腸P-α-syn的表達出現增齡性變化；青年組(0.675 4±0.126 2)、中年組(1.669 9±0.050 2)、老年組(2.240 4±0.060 7)結腸中P-α-syn的表達水平隨著年齡的增加而增多，各組間比較差異均具有統計學意義(P<0.01)。見圖1。

2.2.2直腸P-α-syn的表達情況 隨著年齡的增加，小鼠直腸P-α-syn的表達出現增齡性變化；青年組、中年組、老年組直腸P-α-syn的表達水平隨著年齡的增加逐漸增多，青年組(1.425 6±0.431 1)與老年組(3.681 9±0.113 4)、中年組(1.744 8±0.189 9)與老年組直腸P-α-syn表達均有顯著差異(P<0.01)。見圖2。

圖1 各組結腸P-α-syn的表達情況

圖2 各組直腸P-α-syn的表達情況

2.2.3大腦邊緣葉P-α-syn的表達情況 隨著年齡的增加，小鼠邊緣葉P-α-syn的表達出現增齡性變化；青年組、中年組、老年組大腦邊緣葉P-α-syn的表達水平隨著年齡的增加而增多，青年組(0.083 9±0.013 1)與老年組(0.626 1±0.038 6)、中年組(0.107 8±0.016 4)與老年組邊緣葉P-α-syn的表達差異均具有統計學意義(P<0.01)，見圖3。

圖3 大腦邊緣葉P-α-syn表達情況

2.3結腸、直腸與大腦邊緣葉中P-α-syn含量的相關性分析 結腸、直腸中P-α-syn濃度與邊緣葉P-α-syn的表達均呈顯著正相關，圖4。

圖4 C57BL/6J小鼠結腸、直腸與邊緣葉P-α-syn表達量的相關性分析

3 討 論

PD典型的運動癥狀是肌張力增高、運動不協調等〔11〕。有研究發現，PD 患者出現運動癥狀前，腸神經已經出現 α-syn 異常沉積而導致腸神經受損，進而導致腸道內環境紊亂產生體內慢性低度炎癥刺激〔1〕。腸壁神經系統在慢性炎癥作用下出現類 PD 的病理改變(即α-syn沉積)，腸神經及腸黏膜受損，導致腸功能障礙〔12，13〕。而老齡化也是PD發病的危險因素〔14〕。在老化過程中，負責啟動和調節運動輸出到骨骼肌肉系統的體細胞運動神經系統容易老化〔15〕，黑質紋狀體多巴胺途徑是該系統的一個組成部分，因此，多巴胺信號傳導障礙會導致主要運動功能障礙。研究證實，上述增齡性老化過程與大腸和大腦中的α-syn聚集有關〔16，17〕。α-syn發生聚集的主要原因是其磷酸化，α-syn磷酸化水平增高導致其更易聚集為P-α-syn，其細胞毒性也明顯增高，從而導致多巴胺能神經元的變性壞死〔18〕。本研究結果提示，隨著年齡的增加，消化道腸神經節P-α-syn表達量增加可能與小鼠內臟活動高級中樞邊緣葉的表達量有關。

臨床上，PD的發病過程中，便秘、消化不良等消化道癥狀通常發生于運動障礙之前。本研究也發現，隨著年齡的增加，C57BL/6J小鼠的結腸、直腸及邊緣葉P-α-syn的聚集逐漸增多，運動逐漸遲緩。因此，筆者推測PD患者一些胃腸道癥狀與P-α-syn聚集具有密切的相關性。由于非運動癥狀發生早于運動癥狀，而腸道與大腦邊緣葉中P-α-syn的表達具有相關性，提示能否通過改善腸道功能、增強運動鍛煉等方式降低P-α-syn在腦中的聚集，達到對PD的預防和治療作用。