1，25-(OH)2D3 對阿霉素腎病模型大鼠足細胞損傷及podocin表達缺失的影響

趙丹 陳亞茹 于曼麗 馬國英 楊曉萍 羅星

(石河子大學醫學院 1第一附屬醫院腎病科，新疆 石河子 832002;2生化教研室)

近年來，慢性腎臟病(CKD)發病率呈逐年上升趨勢。腎臟作為人體重要的新陳代謝器官，其病理結構是導致腎臟功能逐漸喪失的因素，目前的治療方法不足以避免這種疾病的發展〔1〕。研究表明，維生素D3缺乏可提高罹患腎病的風險，避免維生素D3缺乏和補充維生素 D3可能是一種既經濟又安全的降低CKD 發病率，并提高其預后的方式〔2〕。維生素D是強效類固醇激素骨化三醇的前體，活化的維生素D3在促進鈣磷吸收、防止血管鈣化、維持宿主對病原體的防御等方面發揮重要作用〔3〕。維生素D受體(VDR)是核受體超家族成員，細胞膜上的VDR磷酸化后與視黃體受體(RXR)結合形成異二聚體，在細胞核內調節維生素D的活性并與維生素D元素(VDREs)結合，在目標基因區域里調節基因表達〔4〕。腎臟足細胞是活性維生素D3〔1,25-(OH)2D〕發揮作用的重要靶器官，在維持腎小球濾過膜的通透性方面發揮關鍵作用〔5〕。研究發現podocin為足細胞重要的標記物，是腎小球足細胞信號傳遞的重要分子蛋白〔6〕。足細胞裂孔膜蛋白(Nephrin)是足細胞主要的裂孔隔膜標記分子，其基因突變是導致腎小球裂孔隔膜蛋白表達異常從而產生蛋白尿的重要原因〔7〕。而關于podocin的研究相對較少，它在CKD中的作用及機制仍不明確。本次研究擬探討1，25-(OH)2D3對阿霉素(ADR)腎病模型大鼠的治療效果及對足細胞podocin定位、表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 90只體重180～220 g的SPF級雄性成熟 Sprague Dawley(SD)大鼠，由新疆醫科大學動物中心提供。動物安置在石河子大學動物養殖中心，并維持1 w適應性喂養。

1.1.2主要藥物和試劑 注射用鹽酸ADR(深圳萬樂藥業有限公司)；骨化三醇(上海羅氏制藥有限公司)；兔單抗 podocin (美國 abcam 公司)；山羊抗兔二抗、PV-9000 通用型二步法檢測試劑盒(北京中杉金橋有限責任公司)；二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒 AR1022 (丹麥 DAKO 公司)。

1.2方法

1.2.1ADR腎病模型的建立 隨機選擇60只SD大鼠，單次尾靜脈注射ADR(劑量為7.5 mg /kg)建立ADR腎病模型，注射2 w后測 24 h 尿蛋白定量，24 h 尿蛋白定量>30 mg提示ADR腎病模型建造成功。對照組予單次尾靜脈注射等量的生理鹽水。

1.2.2給藥 ADR腎病模型建立成功后被隨機分為ADR組、1，25-(OH)2D3治療(治療)組，每組30只。治療組每日給予0.25 μg/kg 的 1，25-(OH)2D3灌胃，對照組與ADR組給予等量的花生油灌胃。于治療第2、4、6、8、10周，各組分批次處死 6 只大鼠，處死前，代謝籠收集 24 h 尿量，腎臟組織剝離，-80°C 保存或4%多聚甲醛固定。

1.3相關檢查

1.3.1一般狀況 ①觀察各組大鼠休息、活動、飲食、排泄等生活習性的變化；② 24 h 尿蛋白定量：各大鼠獨立喂養于代謝籠中，收集 24 h 尿液，檢測尿蛋白含量。

1.3.2大鼠腎臟病理觀察 10%水合氯醛麻醉大鼠，行腎被膜快速剝離術，固定在10%的甲醛中，并嵌入石蠟，蘇木素-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡觀察，供腎組織病理學檢測。

1.3.3免疫組織化學檢測和半定量分析 固定的腎組織石蠟包埋，0.4 μm石蠟切片，脫蠟至水，枸櫞酸緩沖液(pH6.0) 200 ml 高壓抗原修復，冷卻，3% 過氧化氫(H2O2)封閉10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗 5 min、3 次，滴加抗podocin單克隆抗體(1∶500)；4℃孵育過夜；次日早晨復溫、浸洗，滴加反應增強液，PBS 洗 5 min、3次，滴加適量的增強酶標羊抗小鼠/兔 IgG 聚合物，DAB 顯色、復染、中性樹脂封片，光學顯微鏡觀察 podocin 定位。每張切片中，隨機選取5個腎小球視野，Image-pro Plus6.0處理，計算陽性積分吸光度，半定量分析蛋白表達。

1.3.4腎足細胞超微結構的觀察 1 mm3的腎皮質組織先后固定在2.5%戊二醛和1%的鋨酸中，然后過分級乙醇，環氧丙烷脫水，通過標準程序嵌入 Epon812，超薄切片被醋酸鈾著色10 min，然后雷諾鉛檸檬酸鹽染色處理2 min，封片、鏡檢，觀察腎足細胞超微結構。

1.3.5實時熒光定量PCR檢測腎組織podocin mRNA水平 Trizol法提取腎皮質總RNA，逆轉錄成cDNA，實時熒光定量 PCR 檢測腎組織 podocin mRNA水平。podocin上游引物 5′-GTGGCTTCTTGTCCTCTCCT-3′，下游引物 5′-TGTGATAGGTGTCCAGGCAG-3′，擴增產物片段為 185 bp；GAPDH 上游引物5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游引物5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′，擴增產物片段253 bp。反應條件：50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃ 30 s；60℃ 30 s；共 40 個循環。繪制溶解曲線，最終數據以 2-△△Ct進行分析。

1.3.6Western印跡檢測podocin蛋白的表達 取100 mg腎皮質組織，放射免疫沉淀法緩沖液(RIPA)提取總蛋白，二辛可酸(BCA)法測蛋白濃度，平衡濃度后每泳道 50 μg 進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濃縮膠：83 V，30 min；分離膠：110 V，100 min；轉膜：23 V，60 min；轉膜完成后5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。podocin 兔單克隆抗體(1∶2 000)4℃搖床孵育過夜，次日晨TBST洗一抗，山羊抗兔(1∶5 000)室溫 50 r/min孵育2 h，洗二抗后，電化學發光(ECL)試劑暗室曝光，Image Lab 系統處理圖像。

1.4統計學處理 采用SPSS20.0軟件。計量資料多組比較采用方差分析，組間兩兩比較采用 LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1一般狀況和24 h 尿蛋白定量 對照組大鼠狀態佳，活潑好動，機靈靈敏，有較高的應激反應，毛色致密有光澤；ADR組大鼠出現精神、神經系統的改變：疲乏、怠倦少動、對外界刺激反應性較低，喜蜷臥，多飲、多尿，毛色無光澤，較散亂。與對照組比較，ADR組24 h尿蛋白定量明顯增高，1，25-(OH)2D3治療能降低蛋白尿(P<0.05)，見表1。

表1 各組不同時間點 24 h 尿蛋白定量比較

與對照組比較：1)P<0.05；與ADR組比較：2)P<0.05；下表同

2.21，25-(OH)2D3對腎足細胞超微結構的影響 對照組足細胞結構完好，胞核形態良好，足突沿胞體指杵狀向外延伸，相互交錯；ADR組足細胞內有脂滴且呈現細胞空腔、細胞核畸形，基底膜呈節段性增厚、足突被壓扁且融合；1，25-(OH)2D3治療后，治療組畸形細胞核有所修復，基底膜無增厚，足突融合減輕，足細胞數量增加。見圖1。

圖1 1，25-(OH)2D3對ADR腎病模型大鼠足細胞超微結構影響(醋酸鈾染色，×10 000)

2.3腎組織病理學改變 腎臟 HE 染色結果顯示：對照組腎小球形態完好，無腎小管結構病理改變。ADR組出現腎組織結構嚴重異常，第2周末，腎小球出現炎性細胞聚集，基底膜增厚，腎間質纖維化；第10周可見腎小球病理改變加重，纖維樣壞死累及整個腎小球。1，25-(OH)2D3治療后，治療組腎小球病理損傷減輕，且第10周末腎小球形態較對照組無明顯差異。見圖2。

2.4免疫組織化學檢測podocin的定位和表達 podocin 主要定位于細胞膜，且在毛細血管袢呈連續、線性排布；與對照組相比，各周末ADR組 podocin 陽性表達面積明顯降低(P<0.05)；1，25-(OH)2D3治療后，治療組podocin 的表達時間依賴性明顯增強(P<0.05)。見表2，圖 3。

2.51，25-(OH)2D3對ADR腎病模型大鼠腎組織podocin mRNA 表達的影響 對照組 podocin mRNA 表達量較高，與對照組相比，ADR組 podocin mRNA 的表達量顯著降低(P<0.05)；與ADR組相比，隨著1，25-(OH)2D3療程增加，大鼠腎組織 podocin mRNA 的表達有所升高(P<0.05)。見表3。

2.61，25-(OH)2D3對ADR腎病模型大鼠足細胞 podocin 蛋白表達的影響 對照組 podocin 蛋白表達較高，與對照組相比，ADR組podocin表達量顯著降低(P<0.05)；與ADR組比較，經1，25-(OH)2D3治療后，治療組腎小球足細胞 podocin 的表達顯著上調，在第10周末，基本恢復至正常水平。見圖4，表4。

圖2 治療后不同時間點1，25-(OH)2D3 對ADR腎病模型大鼠腎組織病理學影響(HE，×400)

表2 各組治療后不同時間點腎組織 podocin 蛋白半定量表達的比較

圖3 治療后不同時間點1，25-(OH)2D3對ADR腎病模型大鼠腎組織 podocin 蛋白表達的影響(IHC，×400)

表3 治療后不同時間點1，25-(OH)2D3 對ADR腎病模型大鼠腎組織 podocin mRNA表達的影響

圖4 治療后不同時間點1，25-(OH)2D3 對ADR腎病模型大鼠腎組織 podocin 蛋白表達的影響

表4 治療后不同時間點1，25-(OH)2D3 對ADR腎病模型大鼠腎組織 podocin 蛋白表達的影響

3 討 論

CKD最終可進展為終末期腎病，需要長期腎替代治療或腎移植，已經成為危及人類生命和健康的重要疾病之一。CKD的特征是出現腎單位減少、大量蛋白尿、腎功能損害等，這很大程度上歸因于慢性腎小球腎炎、高血壓、代謝綜合征、糖尿病等危險因素〔8〕。ADR模型是目前模擬人類CKD的較為成熟的實驗模型，這種模型的建立簡便、成功率高，蛋白穩定(有報道可達 9 個月〔9〕)，且藥源充足。本實驗通過一次性尾靜脈注射ADR 7.5 mg/kg，也成功建立了ADR模型。

有活性的維生素 D3 缺乏是CKD蛋白尿的關鍵原因，早期補充1，25-(OH)2D3具有重要的腎臟保護作用〔10〕。大量蛋白尿與腎臟損傷密切相關，研究發現1，25-(OH)2D3能有效改善腎病理損傷，發揮腎小球保護作用，減少蛋白尿〔11〕。本研究結果提示，腎組織結構的損傷是加速CKD進程的關鍵，給予1，25-(OH)2D3能有效減緩慢性病程的發展。

圍繞著毛細血管和鮑曼囊高度轉化的腎小球足細胞，足部間相互交錯，形成一個狹窄均勻的動態縫隙網絡，維持足細胞結構和功能的穩定性，是腎小球濾過過程的最后環節〔12〕。近年來，關于腎臟的研究主要集中在 nephrin、CD相關蛋白2(CD2AP)、足細胞標志蛋白(WT)-1 等幾個重要的分子〔13〕。podocin 是最新發現的足細胞特異性標記分子，在足突膜脂筏中發揮著腳手架的作用〔14〕。除了結構作用外，其在腎小球足細胞啟動磷脂酰肌醇 3 激酶/蛋白激酶 B (PI3K/AKT)信號通路〔15〕。已有研究報道nephrin-CD2AP-podocin 復合體的形成，參與 PI3K/AKT 信號分子的傳遞，抑制足細胞凋亡，促進增殖，保護足細胞，改善蛋白尿〔16〕。本實驗結果顯示腎臟足細胞損傷是導致大量蛋白尿的關鍵，為后續臨床治療提供重要的靶標基礎。

綜上，腎臟損傷，尤其腎臟足細胞的損害，包括結構上足突融合及分子水平podocin 的缺失是導致蛋白尿的關鍵原因，而1，25-(OH)2D3在一定程度上能夠修復腎足細胞的損傷，改善 podocin 蛋白表達的缺失，進而減少蛋白尿，發揮其重要的腎保護作用。而1，25-(OH)2D3通過哪條途徑調節 podocin 表達、保護足細胞，有待進一步研究。