膿毒癥患者外周血微小RNA-155和CD4+CD25+Treg細胞表達水平及意義

沈業(yè)周 余嬌陽 周飛 張儉

(杭州師范大學附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，浙江 杭州 310015)

膿毒癥主要是由感染所致的一種全身炎癥反應綜合征，具有病情兇險、病死率高等特點，發(fā)展為膿毒癥休克和嚴重膿毒癥，嚴重威脅人們生命安全及影響生活質(zhì)量〔1,2〕。因此，早期、準確及快速診斷可改善膿毒癥患者預后，具有重要意義〔3〕。微小RNA作為廣泛存在于生物體內(nèi)的高度保守的短小RNA，與多種疾病發(fā)生、生理和病理過程關系緊密。研究顯示，膿毒癥外周血中微小RNA能夠在一定程度上反映機體炎癥情況，且可判定疾病嚴重程度〔4〕。膿毒癥患者可發(fā)生嚴重的免疫功能紊亂，同時也是引起膿毒癥患者死亡的重要原因。CD4+CD25+Treg細胞是新發(fā)現(xiàn)的一種負向免疫調(diào)節(jié)細胞，其可經(jīng)多途徑影響機體的免疫狀態(tài)〔5〕。本研究探討膿毒癥患者外周血微小RNA-155和CD4+CD25+Treg的表達水平及意義。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選自2016年3月至2017年12月杭州師范大學附屬醫(yī)院接受診治的膿毒癥患者80例作為研究對象。納入標準：①經(jīng)臨床指征、生物標志物和微生物學檢查等確診；②患者臨床資料完整；③獲得知情同意，簽訂知情同意書。排除標準：①風濕免疫系疾病、器官移植術后者；②慢性器官衰竭或障礙、血液系統(tǒng)疾病者；③精神疾病者；④惡性腫瘤者。納入的80例膿毒癥患者，男47例，女33例；年齡60～79〔平均(69.83±6.57)〕歲；根據(jù)患者病情程度分為膿毒癥組62例，膿毒癥休克組18例。膿毒癥組男38例，女24例，平均年齡〔(69.17±5.89)〕歲；膿毒癥休克組男9例，女9例，平均年齡(70.43±6.74)歲，另選擇同期健康體檢者60例作為對照組，男37例，女23例；年齡60～78〔平均(69.34±7.53)〕歲。膿毒癥組、膿毒癥休克組與對照組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.792，P<0.05;t=1.402，P<0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1外周血標本采集 所有研究對象于入院當天抽取外周靜脈血4 ml，肝素抗凝，分置于兩管中，每管2 ml，分別用于微小RNA-155表達和CD4+CD25+Treg細胞表達檢測。

1.2.2微小RNA-155表達檢測 采用TRIzol一步法提取總RNA，嚴格依據(jù)美國Invitrogen公司TRIzol試劑盒標準操作。采用紫外分光光度計測定總RNA的吸光度值。引物合成由上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列如下：上游引物：5′-CGTTAATGCTAATCGTGATAG-3′，下游引物：5′-GCAGGGTCCGAGGT-3′。在熒光定量PCR儀進行RT-PCR。反應總體積為25 μl。反應條件：95℃15 min預變性，95℃ 15 s，60℃ 60 s，共35個循環(huán)。采用2-△△Ct法計算微小RNA-155相對表達量。

1.2.3CD4+CD25+Treg細胞表達檢測 取抗凝全血加入試管中，分別加入5 μl的CD25-FITC和CD4-PE單抗，充分混勻后放置于室溫條件下避光反應15 min，加入溶血劑500 μl，放置于37℃下10 min，完全溶血后上美國Beckman-Coulter公司流式細胞儀檢測CD25強陽性的CD4+CD25+Treg表達。

1.3觀察指標 ①觀察兩組氧合指數(shù)和血乳酸水平變化；②觀察各組急性生理學及慢性健康狀況評分系統(tǒng)(APACHE Ⅱ)評分和序貫器官功能障礙評分(SOFA)變化；③觀察各組外周血微小RNA-155表達；④觀察各組外周血CD4+CD25+Treg細胞表達。

1.4統(tǒng)計學方法 運用SPSS22.0軟件進行t、F及χ2檢驗。

2 結 果

2.1各組氧合指數(shù)和血乳酸水平比較 膿毒癥組和膿毒癥休克組氧合指數(shù)明顯低于對照組而血乳酸水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；膿毒癥休克組氧合指數(shù)明顯低于膿毒癥組而血乳酸水平明顯高于膿毒癥組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 各組氧合指數(shù)和血乳酸水平比較

與膿毒癥組比較:1)P<0.05；與對照組比較:2)P<0.05，下表同

2.2各組APACHE Ⅱ評分和SOFA評分比較 膿毒癥組和膿毒癥休克組APACHE Ⅱ評分和SOFA評分明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；膿毒癥休克組APACHE Ⅱ評分和SOFA評分明顯高于膿毒癥組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組APACHE Ⅱ評分和SOFA評分比較分)

2.3各組微小RNA-155相對表達量比較 膿毒癥組和膿毒癥休克組微小RNA-155相對表達量(1.15±0.21、1.52±0.17)高于對照組(0.64±0.15)，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；膿毒癥休克組微小RNA-155相對表達量明顯高于膿毒癥組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4各組CD4+CD25+Treg細胞表達比較 膿毒癥組和膿毒癥休克組CD4+CD25+Treg細胞表達水平明顯〔(1.54±0.38)%、(3.67±1.78)%〕明顯高于對照組〔(0.41±0.12)%〕，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；膿毒癥休克組CD4+CD25+Treg細胞表達水平明顯高于膿毒癥組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討 論

膿毒癥是感染、休克、燒傷、創(chuàng)傷等危急重患者的嚴重并發(fā)癥之一，同時也是誘發(fā)多器官障礙綜合征、感染中毒性休克的重要因素〔6～8〕。由于膿毒癥病情進展迅速、病死率高，給臨床工作造成很大困難〔9～12〕。 微小RNA在參與炎性疾病病理生理過程、維持機體自身穩(wěn)態(tài)等方面具有重要效應，其微小RNA-155是近年來學者研究熱點之一，被認為是膿毒癥炎癥網(wǎng)絡效應的平衡點參與病理生理過程，可作為膿毒癥早期診斷的敏感指標之一，同時也可能是今后膿毒癥接受基因治療和免疫調(diào)理的重要靶點〔13，14〕。相關研究報道表明，體內(nèi)微小RNA-155表達與膿毒癥免疫失衡程度存在相關性，從而提高膿毒癥病死率，并且對膿毒癥病情嚴重程度具有一定預警作用〔15〕。本文研究表明，膿毒癥組和膿毒癥休克組微小RNA-155表達增高，且隨著病情的發(fā)展升高越明顯，但其具體作用機制尚未完全闡明，還需后續(xù)繼續(xù)深入研究，提供可靠的參考價值。

學者認為膿毒癥的本質(zhì)主要是機體對細菌感染出現(xiàn)的過度反應，病原體及其毒素導致炎癥損害以及機體免疫功能狀態(tài)具有重要作用〔16，17〕。CD4+CD25+Treg最早在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，能夠特異性地表達CD25，是負向免疫調(diào)控的一類細胞，具有廣泛的免疫抑制效應，同時還影響機體的獲得性免疫和天然免疫，如介導Th1/Th2漂移，調(diào)節(jié)抗炎與促炎介質(zhì)水平從而影響免疫細胞如中性粒細胞、T細胞和單核巨噬細胞的凋亡和增殖。CD4+CD25+Treg在膿毒癥輔助的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡中主要發(fā)揮對細胞免疫的抑制作用〔18〕。當膿毒癥時機體主要表現(xiàn)為CD4+CD25+Treg水平持續(xù)上升，加劇免疫無反應狀態(tài)。臨床上通過對CD4+CD25+Treg檢測能夠為了解膿毒癥患者免疫狀態(tài)對患者臨床治療和預后具有重要意義〔19〕。本文研究表明，膿毒癥組和膿毒癥休克組CD4+CD25+Treg細胞表達增高，且隨著病情的發(fā)展升高越明顯。膿毒癥患者病情加重，發(fā)生細胞免疫低下可能與CD4+CD25+Treg上升有因果關系，認為其機制可能是由于CD4+CD25+Treg通過導致抗炎細胞因子如細胞白介素(IL)-10和轉化生長因子(TGF)-β的升高，抑制淋巴細胞增殖，引起T淋巴細胞彼此殺傷，使T細胞總數(shù)及活化的T細胞數(shù)量下降。綜上所述，膿毒癥患者外周血微小RNA-155和CD4+CD25+Treg呈高表達，且與病情進展密切相關，有助于診斷和指導治療。