NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白I-κBα的磷酸化與結(jié)直腸癌組織發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)性

陳昱江 楊茂 李騰仙

(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550001)

I-κB是核因子(NF)-κB的抑制蛋白，靜息狀態(tài)下，I-κB抑制NF-κB活化，當(dāng)刺激因子刺激細(xì)胞時(shí)，I-κB蛋白磷酸化激活NF-κB〔1,2〕。NF-κB是一種可以介導(dǎo)免疫細(xì)胞增殖、分化和炎性因子產(chǎn)生的物質(zhì)，NF-κB通路異常會(huì)導(dǎo)致慢性炎癥、自身免疫性疾病和腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移〔3,4〕。結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展與NF-κB通路異常有密切聯(lián)系。本研究針對(duì)I-κB蛋白磷酸化在炎癥因子高表達(dá)的結(jié)直腸癌組織中的作用進(jìn)行探討。

1 資料和方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2018年1月貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院進(jìn)行結(jié)直腸癌治療的患者30例作為病例組，另選取2017年1月至2018年1月行腸鏡活檢且結(jié)直腸正常的患者30例作為對(duì)照組。病例組男21例，女9例，年齡40～70歲，平均年齡(59.33±8.45)歲，體重55～75 kg，平均體重(62.46±7.42)kg；對(duì)照組男20例，女10例，年齡40～70歲，平均年齡(58.25±8.74)歲，體重55～75 kg，平均體重(63.48±7.47)kg，病例組取癌組織、癌旁2 cm和距離癌組織10 cm以上的健康組織各1例。納入標(biāo)準(zhǔn)：病例組經(jīng)乙狀結(jié)腸鏡、纖維結(jié)腸鏡檢查、活體組織檢查確診為結(jié)直腸癌，對(duì)照組經(jīng)乙狀結(jié)腸鏡、纖維結(jié)腸鏡檢查、活體組織檢查確診為結(jié)直腸正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：有其他腫瘤疾??；患有嚴(yán)重心臟、肝臟、腎臟功能不全；依從性差?；颊呔炇鹬橥鈺?shū)，研究過(guò)程符合人體倫理學(xué)原則，研究過(guò)程通過(guò)本院的倫理審查。兩組患者基線資料比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2標(biāo)本儲(chǔ)存 血液標(biāo)本采集后加入乙二胺四乙酸(EDTA)進(jìn)行抗凝處理，并離心取上清，放入-80℃(Thermo)儲(chǔ)存?zhèn)溆?；所有組織標(biāo)本在取出后立即置入液氮中(-198℃)進(jìn)行保存。

1.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 采用ELISA試劑盒(Sigma，美國(guó))檢測(cè)兩組血清炎癥因子白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達(dá)量。

1.4RT-QPCR 組織RNA的抽提采用OMEGA總RNA試劑盒(R6834-02)，并嚴(yán)格按著說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。引物序列：IL-1 上游5′ CCACAGACCTTCCAGGAGAATG 3′,下游5′ GTGCAGTTCAGTGATCGTACAGG 3′;IL-6 上游5′AGACAGCCACTCACCTCTTCAG 3′，下游5′ TTCTGCCAGTGCCTCTTTGCTG 3′；TNF-α上游5′ CTCTTCTGCCTGCTGCACTTTG 3′，下游5′ ATGGGCTACAGGCTTGTCACTC 3′。Q-PCR操作過(guò)程和反應(yīng)體系按照TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)，Bulk(RR420L)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，結(jié)果采用2-△△Ct表示。

1.5Western印跡法 抽提組織蛋白后加入TaKaRa 1×結(jié)合緩沖液100℃ 3～5 min變性，存入-20℃進(jìn)行保存，采用碧云天Bradford蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量后每個(gè)孔10 μl樣品進(jìn)行上樣，以恒電壓120 V進(jìn)行電泳65 min，后以恒電流400 mA進(jìn)行濕轉(zhuǎn)70 min。 NF-κB和I-κB一抗和二抗均購(gòu)于賽信通公司(CST)，一抗稀釋濃度1∶2 000，二抗稀釋濃度1∶1 000，發(fā)光液為購(gòu)買(mǎi)于碧云天的超敏電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒，1∶1等體積混合A、B液，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，采用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組血清IL-1、IL-6、TNF-α表達(dá)水平比較 病例組血清炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組血清IL-1、IL-6、TNF-α表達(dá)水平比較

2.2不同組織中炎癥因子的表達(dá) 癌組織中IL-1、IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)量顯著高于癌旁組織和正常組織，且癌旁組織上述指標(biāo)顯著高于正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同組織中炎癥因子的表達(dá)情況

與癌旁組織比較：1)P<0.001;與正常組織比較：2)P<0.001

2.3不同組織中TLR通路轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和I-κB的表達(dá) NF-κB和β-actin在癌組織、癌旁組織和正常組織中的表達(dá)灰度值相比，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但正常組織的I-κB蛋白表達(dá)量顯著高于癌旁組織和癌組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表3。

2.4I-κB與不同組織中炎癥因子表達(dá)的關(guān)聯(lián)性 病例組中I-κB的表達(dá)與組織中炎癥因子IL-1(r=-0.551，P=0.031)、IL-6(r=-0.658，P=0.004)和TNF-α(r=-0.947，P=0.000)表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。

表3 不同組織中NF-κB和I-κB的表達(dá)灰度分析

與正常組織比較：1)P<0.001

3 討 論

結(jié)腸直腸癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，好發(fā)于中年以上的男性，以40～70歲最為多見(jiàn)，主要臨床表現(xiàn)為排便習(xí)慣改變、便血、局部腹痛等癥狀〔5〕。研究證實(shí)，I-κB基因表達(dá)缺失和NF-κB持續(xù)激活是該病發(fā)生的主要原因〔6〕。I-κB是NF-κB信號(hào)通路中重要的成員，參與NF-κB的激活與轉(zhuǎn)錄〔7〕。在靜息狀態(tài)下，I-κB和NF-κB雜二聚體以結(jié)合的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，抑制NF-κB的活化，當(dāng)各種刺激因子(如氧自由基、病毒蛋白、細(xì)胞因子等)級(jí)聯(lián)信號(hào)迅速激活I(lǐng)-κB激酶(IKK)復(fù)合物，被激活的IKK磷酸化I-κB N端的32、36位絲氨酸，磷酸化(p)-I-κBα21、22位賴氨酸發(fā)生泛素化降解并脫離NF-κB，使NF-κB核定位信號(hào)區(qū)(NLS)暴露，促進(jìn)NF-κB磷酸化、核轉(zhuǎn)移和進(jìn)入細(xì)胞核，介導(dǎo)特異性基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)〔8，9〕。此時(shí)NF-κB持續(xù)激活，介導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞因子釋放。本研究結(jié)果說(shuō)明I-κB基因表達(dá)缺失使原本處于靜息狀態(tài)的NF-κB被持續(xù)激活，促進(jìn)了機(jī)體免疫應(yīng)答和炎性因子的產(chǎn)生。研究表明，炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α水平上升能進(jìn)一步促進(jìn)NF-κB活化〔10〕，炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α水平和NF-κB被激活起相互促進(jìn)作用。隨著NF-κB表達(dá)的升高，越來(lái)越多I-κB表達(dá)缺失，所以病例組中I-κB的表達(dá)與組織中炎癥因子IL-1、IL-6和TNF-α水平在Pearson線性相關(guān)結(jié)果顯示中呈負(fù)相關(guān)。

本研究結(jié)果說(shuō)明炎性因子的表達(dá)水平和所處組織環(huán)境有關(guān)。研究表明，炎性反應(yīng)和腫瘤之間存在密切聯(lián)系，高達(dá)20%的腫瘤來(lái)源于慢性炎癥反應(yīng)和持續(xù)性感染〔11〕。在慢性炎性反應(yīng)過(guò)程中，炎性細(xì)胞產(chǎn)生的炎性因子和細(xì)胞因子將激活NF-κB信號(hào)通路，增強(qiáng)癌前細(xì)胞的逃逸能力〔12〕。研究證實(shí)，腫瘤的生長(zhǎng)依賴于腫瘤血管的生成，而NF-κB在腫瘤血管形成過(guò)程中可能也起到關(guān)鍵作用〔13，14〕。一項(xiàng)研究指出，許多血管生成因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β、TNF-α、IL-8等均含有NF-κB的特異性結(jié)合位點(diǎn)，表達(dá)受到NF-κB的調(diào)控〔15〕。mRNA攜帶著遺傳信息，在蛋白質(zhì)合成時(shí)充當(dāng)模板，mRNA在癌組織中表達(dá)量最高，說(shuō)明癌組織炎性因子IL-1、IL-6和TNF-α水平最高，也進(jìn)一步說(shuō)明癌組織中NF-κB被激活的數(shù)量最大，I-κB表達(dá)缺失最多，而正常組織中IL-1、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)量最低，推測(cè)I-κB蛋白磷酸化在炎性因子高表達(dá)的結(jié)直腸癌中起到重要作用，I-κB表達(dá)下調(diào)是導(dǎo)致結(jié)直腸癌發(fā)病和炎性反應(yīng)的主要原因。

目前關(guān)于細(xì)胞免疫和炎性疾病的發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床用藥多以非特異性抗炎藥物和細(xì)胞毒性藥物為主，如糖皮質(zhì)激素、丙種球蛋白等。長(zhǎng)期使用這些藥物副作用較大，針對(duì)性治療效果較差，給患者生存質(zhì)量帶來(lái)不利影響。本研究結(jié)果推測(cè)，I-κB表達(dá)缺失可能介導(dǎo)了結(jié)直腸癌中炎性因子的高表達(dá)，靶向調(diào)節(jié)I-κB具有潛在治療前景。但靶向調(diào)節(jié)I-κB能否成為治療結(jié)直腸癌患者炎性反應(yīng)、抑制腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的新方法，還有待進(jìn)一步開(kāi)展大量臨床研究。