野生櫻桃可溶性蛋白的含量及種子形態

李長進，王永波*，張洪芬，秦世會，陳 燮

(1.貴州大學 林學院，貴州 貴陽 550025；2.貴陽新天學校，貴州 貴陽 550018；3.畢節清池鎮普安學校，貴州 畢節 551700)

野生中國櫻桃(Prunuspseudocerasus)在我國華北、華中、華南和西南均有一定的分布[1]，其作為寶貴的物種資源基因庫，對櫻桃新品種改良和進化，促進植物資源的培育、開發與利用具有重要的價值[2]。貴州地區因其特殊的地形、氣候和人文環境條件，現存野生櫻桃種質資源豐富，且不同區域環境下品種類型多樣，不少資源果實性狀優良[3-4]。受人類活動影響較小的畢節山區分布有自然生長的野生櫻桃植株，樹高25 m，胸徑18 cm，植株適應性、抗逆性和豐產性表現均較好。

可溶性蛋白含量的測定是果實品質和營養價值重要評定指標[5]，Bradford法是植物組織可溶性蛋白定量測定的常用方法，具有快速、靈敏、特異性強和干擾少等優點[6-11]。種子作為植物的主要繁殖器官其顏色、大小和形狀等特征具有遺傳穩定性。種子形態特征對于植物分類和種子質量管理具有重要意義[12-14]。鑒于此，采用Bradford法測定貴州省畢節市的野生櫻桃果實可溶性蛋白含量，并對其種子形態進行初步分析，以期為貴州野生櫻桃的資源保護與選育利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

野生櫻桃采自貴州省畢節市，105.878 4°E、27.634 3°N，海拔1 072 m，采摘新鮮野生櫻桃果實后，立即裝入冷藏箱后運回實驗室，采用液氮處理后放置于-80℃超低溫冰箱中進行貯藏。

測定試劑主要有牛血清白蛋白(Solarbio)和考馬斯亮藍G-250(Solarbio)。

主要儀器與設備：UV-9000S紫外分光光度計；WinSEEDLE種子和針葉圖像分析系統。

1.2 方法

1.2.1 果實可溶性蛋白含量的測定

1)考馬斯亮藍G-250(CBB)溶液的制備。精確稱取100 mg CBB倒入裝有50 mL 95%乙醇燒杯中，用玻璃棒充分攪拌，12 000 r/min離心15 min去除沉淀，加入85%磷酸溶液100 mL，并用蒸餾水將溶液定溶至1 000 mL后，倒入棕色瓶中避光保存。

2)標準蛋白溶液的制備。精確稱取25 mg牛血清白蛋白，采用蒸餾水對牛血清白蛋白進行溶解后，逐漸加入蒸餾水把溶液定溶至100 mL，用移液管吸取溶液40 mL，蒸餾水稀釋定溶至100 mL，即得100 μg/mL牛血清白蛋白(BSA)標準溶液，把標準溶液放置于冰箱中冷藏保存。

3)CBB溶液及其與BSA和樣品蛋白反應液吸光光譜的掃描。分別吸取0.5 mL的BSA溶液和野生櫻桃果肉粗提液于10 mL具塞試管中，加入5 mL的CBB溶液充分混合。以CBB溶液為空白對照，在400～800 nm掃描CBB-BSA復合物溶液和CBB與野生櫻桃果肉提取液反應溶液的吸收光譜，確定溶液的最大吸光度值和最大吸收波長。

4)繪制標準曲線。將BSA溶液按表1制成1 mL的6個濃度系列，分別加入5 mL的CBB溶液并充分混合均勻，室溫條件放置5 min，在595 nm處測定吸光度值。以BSA溶液濃度值為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。

表1 繪制標準曲線的各試劑添加量Table 1 Reagents adding amount for standard curve drawing

5)可溶性蛋白的提取。稱取野生櫻桃果肉0.68 g，加入5 mL磷酸緩沖液作可溶性蛋白浸提液，在冰浴條件下充分研磨后，用磷酸緩沖液沖洗研缽后一并移入至10 mL離心管中，4℃，12 000 r/min離心15 min，取出清液并測定與CBB反應液在595 nm處的吸光度，每個樣品3次重復，計算可溶性蛋白含量，取其平均值。

6)精密度試驗。精確移取1 mL相同濃度標準蛋白溶液6份，分別加入5 mL CBB溶液，充分混勻孵育5 min后測其吸光度，計算吸光度的RSD。

7)加標回收率試驗。精確移取1 mL已測定可溶性蛋白含量的樣品蛋白提取液3份，分別準確加入標準蛋白溶液(BSA)0.2 mL、0.3 mL和0.4 mL，測定混合溶液的蛋白質含量，計算加標回收率。

1.2.2 野生櫻桃種子形態 選取85個采集的野生櫻桃果實，稱重后去除果肉，將果核洗凈晾干，用游標卡尺分別量取其長軸長度和縱軸長度，與WinSEEDLE(分辨率600 dpi)[15]掃描分析的數據進行比較分析。

1.3 數據處理

采用Excel 2010 和SPSS 20.0對各項測定數據進行統計與分析。

2 結果與分析

2.1 櫻桃果實可溶性蛋白的含量

2.1.1 CBB-BSA和CBB-野生櫻桃果肉提取液的吸收光譜圖 由圖1可知，CBB-BSA和CBB-野生櫻桃果肉提取液的最大吸收峰分別處于593 nm和599 nm，與MARION等[6，16]的研究結果(595 nm)相近，故在測定時可作為吸光度值。CBB-野生櫻桃果肉提取液與CBB-BSA吸收曲線相比，CBB-野生櫻桃果肉提取液溶液的吸收光譜在620 nm和720 nm附近有吸收肩峰位，推測與其可溶性蛋白的組成和結構與標準蛋白不同有關，也可能與含有其他可與CBB結合的大分子有機物質干擾有關。

注：a為標準蛋白溶液(BSA)+考馬斯亮藍G-250(CBB)的反應液的吸收光譜；b為櫻桃果實提取液+考馬斯亮藍G-250(CBB)的反應液的吸收光譜。
Note:a,absorption spectra of Coomassie brilliant blue G-250(CBB)dye complexes with Bovine serum albumin(BSA)；b，absorption spectra of CBB dye complexes with wild cherry fruit extract.

圖1標準蛋白和野生櫻桃可溶性蛋白提取液的吸收光譜
Fig.1 Absorption spectrum of BSA and wild cherry soluble protein extract

2.1.2 標準曲線和回歸方程的建立 以BSA溶液中蛋白質含量與595 nm處吸光度值的變化繪制標準曲線(圖2)，得出的線性回歸方程為y=0.005 4x+0.014(R2=0.997 4)。說明蛋白質含量(0～100 μg/mL)與吸光度值具有良好的線性關系，試驗條件滿足要求。

2.1.3 可溶性蛋白含量 試驗測得野生櫻桃果實可溶性蛋白含量為83.99 mg/100g FW。

2.1.4 精密度及加標回收率 經精密度試驗，并通過計算得出吸光度值的RSD為1.68%，系統偏差不顯著，說明試驗精密度較好。經加標回收率試驗計算得加標回收率為96%～102%，在95%～105%范圍內，RSD為2.46%(小于5%)，試驗準確性符合測定要求，表明該試驗方法可用于野生櫻桃果實可溶性蛋白的快速定量分析。

圖2 野生櫻桃可溶性蛋白質標準曲線Fig.2 Standard curve of soluble protein of wild cherry

2.2 種子形態

由圖3可知，野生櫻桃果實呈卵圓形(圖3a)，平均長軸長度為(8.03±0.05)mm，平均短軸長度(7.15±0.12)mm，果實均重0.78 g，果實可食率為44.5%。果核(內果皮)和種子為卵圓形(圖3b和圖3d)，淺黃色。種子被1層堅硬致密的木質化果核包被，果核縫合線緊密，不易剝離，種胚處于種子頂部(圖3c)。

對WinSEEDLE掃描數據與游標卡尺測量數據分別進行檢驗得出二者間差異達顯著水平(P<0.05)。說明WinSEEDLE掃描的準確度符合測定要求，故選定該測量值為分析數據。野生櫻桃種子的長度為(6.73±0.24)mm，寬度為(5.24±0.19)mm，厚度為(4.38±0.21)mm，縱橫徑比為0.78±0.03，周長為(18.89±0.64)mm。

注：a為野生櫻桃果實；b為帶殼種子；c為去殼種子；d為櫻桃種子WinSEEDLE投影掃描圖。
Note:a，wild cherry fruit;b,wild cherry seed with shell;c,wild cherry seed without shell;d,WinSEEDLE scanning map of wild cherry seeds.

圖3 野生櫻桃種子的形態
Fig.3 Wild cherry seed morphology

3 結論與討論

Bradford法中用95%乙醇來溶解CBB，但高濃度乙醇會對蛋白質作用產生影響，為降低干擾，在不影響CBB溶解的前提下，可適當降低乙醇的濃度，現通常選用90%乙醇來溶解CBB。野生櫻桃果肉蛋白提取液是一種復雜成分提取液，其中的酚類物質等也會干擾試驗結果[17]。因此，消除試驗過程中的干擾可使Bradford法測定蛋白含量更加準確可靠。試驗條件下，蛋白質含量與吸光度值具有良好的線性關系線性回歸方程為y=0.005 4x+0.014(R2=0.997 4)，表明試驗條件滿足要求。

野生果樹植物資源經過長期的環境適應過程，逐漸形成了獨特的適應性和抗逆性等，是育種和品種改良的寶貴基因庫[18]。植物的果實和種子具有比較穩定的遺傳特征，在植物分類的遺傳上具有重要的參考價值[19]。果實和種子的大小可用質量、長及寬來體現，其中質量是果實大小的實際反映，長、寬是果實外觀大小的直觀表現[20]。試驗結果與陳濤等[21]收集的貴州畢節地區幾種櫻桃果實(S1～S7)測量值相比，果型明顯偏小，果實可食率約44%。樣品采集于受人類活動影響較小的畢節市山區自然分布生長的野生櫻桃植株，樹高25 m，胸徑18 cm，調查片區零星分布。實地觀測植株適應性、抗逆性和豐產性表現均優。標準偏差變幅最大的是種子長度，其直接決定果形的大小。

采用Bradford法測定野生櫻桃果肉中可溶性蛋白質含量，快速靈敏、準確度高、重現性好，是一種較好的測定方法。野生櫻桃果肉中可溶性蛋白質含量為83.99 mg/100g FW，可溶性蛋白含量因不同品種和測量方法而呈現不同的結果，該野生櫻桃較洪莉等[22]選定的幾種櫻桃果實可溶性蛋白含量高。果實和種子為卵圓形，果型較小，果實長(8.03±0.05)mm、寬(7.15±0.12)mm，均重為0.78 g，可食率為44.5%。種子長(6.73±0.24)mm、寬(5.24±0.19)mm、厚(4.38±0.21)mm、寬長比為0.78±0.03。該野生櫻桃適應性強、豐產性好，具有很高的育種利用價值。