DNA甲基化與子宮內膜異位癥內膜容受性的研究進展

阮蒙佳 程 靜

子宮內膜異位癥(endometriosis，EMS)是常見的婦科良性疾病，有10%～15%的育齡婦女患有EMS[1]。EMS直接影響女性的生育功能，不孕婦女中EMS的發病率高達35%～50%[2]，此外EMS患者合并不孕的發生率達30%～50%。EMS存在多種可能造成生育能力低下的機制，包括卵泡發育改變、卵母細胞質量差、受精能力受損、植入缺陷、植入能力降低等。對EMS患者行體外受精(invitrofertilization，IVF)后胚胎移植(embryo transfer，ET)，移植率高達85%，但臨床妊娠率僅20%，提示子宮內膜容受性下降導致的胚胎著床缺陷可能是EMS患者不孕的主要原因之一。

子宮內膜容受性是子宮內膜對胚胎的接納能力，包括胚胎黏附至完成著床的過程，該特定階段依賴卵巢激素刺激，因此具有嚴格的時間和空間限制性。這一功能性和短暫性的階段被稱作窗口期，在人類通常認為是分泌期中促黃體素(luteinizing hormone，LH)峰后的6～10 d，持續時間約48 h[3]。子宮內膜容受性可由外周激素、細胞因子、同源框(homeobox，HOX)基因、骨橋蛋白、DNA甲基化、微RNA(miRNA)等因素調控。

1 DNA甲基化與EMS

1.1 DNA甲基化 表觀遺傳學是指在不改變DNA堿基排列順序的情況下影響基因表達。DNA甲基化、組蛋白修飾、miRNA、基因組印記等為常見的表觀遺傳調控機制。DNA甲基化是指在真核生物基因組中胞嘧啶的5’C端添加1個甲基，使其形成5-甲基胞嘧啶的修飾過程；對于哺乳動物，這種修飾主要存在于胞嘧啶-鳥嘌呤雙核苷酸(CpG sites)之間，當啟動子(promoter)的CpG島(CpG island)發生甲基化時，相關基因由于轉錄活性受抑制而沉默表達。DNA甲基化是人類基因組的一種重要的表觀遺傳修飾，在細胞分化、基因表達、基因組印記和諸多其他細胞調控過程中發揮重要作用。

在真核生物中，DNA甲基化由DNA甲基轉移酶(DNMTs)催化，目前已知DNMTs包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。DNMT1主要負責維持DNA甲基化狀態，而DNMT3a、DNMT3b則主要參與新甲基化位點的形成[4-5]。

1.2 EMS中DNA甲基化異常 DNA甲基化作為表觀遺傳學修飾方式之一，是近年來研究的熱點。異常的DNA甲基化通常被認為是腫瘤和其他多種疾病發生的重要機制，研究表明其在EMS患者患病過程中也發揮重要作用。EMS患者中異常表達的DNMTs通常被認為是引起DNA甲基化異常的決定性因素。既往Wu等[6]的研究結果表明，與對照組相比，EMS患者異位內膜中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b表達均升高。但楊娟等[7]的研究發現，EMS患者異位和在位內膜中DNMTs的表達均低于正常對照組。近期Hsiao等[8]的研究表明，由于DNMT1的下調，子宮內膜基質細胞的基因組在全局范圍內都是低甲基化的。造成上述差異的原因可能與子宮內膜上皮細胞與間質細胞未進行分離檢測，以及患者間的遺傳異質性有關。

另有眾多研究表明，在EMS與子宮內膜上皮細胞和基質細胞中特定基因的低甲基化和高甲基化都有關，例如：高甲基化的基因有HOX、孕激素受體(PR)-B、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)等，前兩者與子宮內膜容受性密切相關，后者與異位內膜的侵襲和轉移關系緊密；低甲基化的基因有雌激素受體(ER)-β、類固醇生成因子-1(steroidogenic factor-1，SF-1)、芳香化酶(aromatase)，它們作為人體類固醇激素合成和發揮作用的關鍵要素，參與并促進異位內膜組織存活與擴增。

異常的DNA甲基化通過作用于子宮內膜中某些基因的表達，從而影響子宮內膜的容受性，可能是EMS患者不孕的重要原因。

2 ER和PR

2.1 雌、孕激素 雌激素和孕激素均為類固醇激素，是子宮內膜組織的主要調控因子，它們在月經周期的不同階段調控數百個基因的表達。雌、孕激素與子宮內膜上相應的受體結合，通過介導信號轉導，調控基因表達。其介導作用涉及多種生殖功能，包括胚胎植入、滋養細胞侵襲、蛻膜化，以及隨后功能性胎盤的形成，這些都對妊娠的建立和維持至關重要。其中下游信號包括HOXA10、FOXO1、CCAAT-增強子結合蛋白(C/EBP-β)等，這些信號調節細胞分化，促進子宮內膜容受性建立與胚胎植入[9]。近年來研究顯示，EMS患者體內的雌、孕激素水平均正常，但可能由于某些受體的改變，導致雌、孕激素介導的蛻化信號通路產生異常，從而影響子宮內膜容受性和胚胎植入。

2.2 ER的DNA甲基化 ER有ER-α和ER-β兩種亞型，在異位子宮內膜和正常內膜中均有表達。ER-α/ER-β比值的改變可能會改變細胞對雌激素的接受能力。Bulun等[10]研究發現，EMS患者中DNMT1的下調可能導致ER-β基因區域的低甲基化，從而導致ER-β表達增加；ER-β又被證明與ER-α的啟動子位點結合，使其活性下調；ER-α可以調節PR基因的表達，因此ER-α表達的降低會導致PR水平的降低，進而產生孕激素信號缺失和孕激素抵抗，不利于子宮內膜容受性的建立[11-12]。

Talbi等[13]研究發現，在分泌中期，正常子宮內膜ER-α下調，雌激素水平下降，可能在激活著床中發揮關鍵作用。另有研究[14]結果表明，部分EMS患者的窗口期存在過度表達的ER-α，這可能損害了子宮內膜容受性。上述兩個結論存在差異可能與所研究的組織位置和疾病發生的時間有關。Han等[15]推測可能是孕激素抵抗降低了ER-α表達，所以EMS患者早期子宮內膜組織可能比晚期組織攜帶更多的ER-α。

綜上，雌激素通過與ER結合，介導多種信號(包括PR)而產生轉錄效應，這對子宮內膜容受性的建立至關重要。異常的DNA甲基化可能是使EMS子宮內膜中ER-α/ER-β比值發生改變，導致內膜容受性受損的表觀遺傳機制之一。

2.3 PR的DNA甲基化 PR屬于核受體家族。孕激素通過與PR相結合，調控某些特定基因表達而發揮生理作用。PRs對妊娠早期的成功至關重要，EMS患者子宮內膜DNA甲基化的異常可能會影響早期PR維持妊娠的成功率。

蛻膜化指子宮內膜基質成纖維細胞分化形成蛻膜，蛻膜組織的形成對于妊娠的建立和維持至關重要。蛻膜化過程要求間質細胞中環磷酸腺苷(cAMP)水平升高，進而誘導或激活其下游蛻膜化誘導因子，如HOXA10、FOXO1、C/EBP-β等的表達，從而作用核受體的轉錄功能，最終完成內膜蛻膜化。而PR參與了與這些蛻膜化因子的相互作用，使其發揮效應，因此PR在內膜容受性的形成中起關鍵作用。既往研究證實EMS發展與不完全蛻膜過程之間存在重疊遺傳特征。

PR有兩種亞型，PR-A主要表達于子宮組織和卵巢，而PR-B則更多地參與乳腺發育。研究[16-17]表明，PR-A敲除小鼠因孕激素調節基因表達缺失而導致胚胎植入缺陷；然而，敲除PR-B的小鼠有生育能力，并且能維持正常妊娠。由此推斷PR-A與小鼠生殖的關系更為密切，但此結論能否外推到人仍待證實。

在正常的人子宮內膜上皮細胞中，隨著增殖期雌激素水平升高，PR-A、PR-B水平均升高，但在分泌期隨著血清孕激素水平上升而降低，PR-A/PR-B在整個正常月經周期中保持不變。PR-A/PR-B比值的改變可能是EMS患者發生孕激素抵抗的機制之一。Nasu等[12]在小鼠和狒狒EMS模型中觀察到子宮內膜中PR-A水平降低，PR-B/PR-A升高，總PR蛋白表達量較對照組增加。Fazleabas等[18]的研究結果表明，中、重度EMS患者子宮內膜內總PR水平呈升高趨勢。這種PR表達的改變可能導致孕激素反應減弱和PR表達減少。但是Samartzis等[19]的研究結果表明，與正常婦女相比，不同類型EMA患者的上皮細胞中總PR表達量下降更為常見。絕大多數研究[20-22]結果表明，EMS患者在位內膜中PR-B基因發生高度甲基化，使其表達量顯著下降，PR-B/PR-A比值降低，PR蛋白總表達量下降，從而影響異位病灶對孕激素的反應，產生孕激素抵抗。也有研究[23]表明，孕激素抵抗是影響EMS患者子宮內膜容受性并造成其不孕的重要原因。

2.4 孕激素抵抗 正常人和EMS患者體內的雌、孕激素水平正常，且內膜組織均表達PR，但EMS患者內膜中受體產生表觀遺傳改變，進而產生分子水平上的孕激素反應減弱或失調，稱之為孕激素抵抗，在EMS患者中出現比率高達9%[20]。

泌乳素表達作為孕激素介導的反映子宮內膜間質細胞蛻膜化程度的分子標記之一，早期研究檢測到異位內膜中間質細胞泌乳素mRNA顯著下降，從而表明異位病灶中存在孕激素抵抗，導致間質蛻膜化不佳。Kao等[24]的研究同樣顯示，EMS患者在位內膜分泌期由孕激素介導的一系列下游基因表達下調。以上研究結果均表明，EMS患者存在孕激素抵抗現象。導致EMS患者不孕的原因眾多，其中孕激素抵抗導致的子宮內膜與受精卵發育不同步和子宮內膜容受性降低是影響胚胎植入的關鍵原因之一。

孕激素與子宮內膜容受性關系密切，也可抑制異位內膜的生長和炎性反應。因此，孕激素抵抗使內膜容受性下降，直接影響生殖，也使臨床上使用孕激素類藥物緩解EMS患者的慢性盆腔疼痛、痛經等癥狀的療效甚微。

綜上，EMS患者子宮內膜中ER和PR的異常DNA甲基化可作為其子宮內膜容受性下降的原因之一。此外，孕激素結合受體激活的下游信號包括HOXA，對子宮內膜容受性也產生相關影響。

3 HOX基因

HOX基因首先在果蠅體內被發現，它通過保守的同源域作為轉錄調控因子來控制胚胎形態發生。最初認為HOX基因只在胚胎發育過程中表達，但后續研究發現HOX基因編碼同源域轉錄因子，在子宮內膜中表達呈現動態趨勢，作為內膜生長、分化和胚胎植入的必要因素之一。人的HOX基因可分為A、B、C、D共4個基因簇。HOXA基因與生殖道發育和功能關系密切，其中HOXA9和HOXA13分別主要表達于輸卵管和陰道，HOXA10主要在子宮表達，HOXA11則主要在子宮和宮頸表達。本文著重介紹與內膜容受性密切相關的HOXA10和HOXA11。

3.1 孕激素與HOX基因 雌、孕激素均能介導內膜組織中HOXA10、HOXA11的表達上調，且孕激素的調控能力強于雌激素，兩者聯合作用的效果強于單一激素作用。PR自身異常DNA甲基化產生孕激素抵抗，使其不能有效調控下游靶基因HOXA10和HOXA11的表達，使孕激素在建立子宮內膜容受性中不能發揮有效作用。同時，HOXA10和HOXA11自身的高甲基化也阻礙了孕激素產生調節作用。甲基化的相對永久性可能是子宮內膜容受性下降和治療EMS相關不孕妊娠率低的可能原因。

3.2HOXA10和HOXA11 多項研究表明，HOXA10和HOXA11對小鼠的生育能力都是必需的。雖然HOXA10或HOXA11敲除小鼠產生正常數量的胚胎，并且這些胚胎在野生型代孕小鼠中存活，但是來自代孕小鼠的野生型胚胎不能在HOXA10和HOXA11缺陷小鼠子宮中著床，這表明HOXA10和HOXA11影響了胚胎著床，與小鼠子宮內膜容受性關系緊密。Bagot等[25]發現，在小鼠子宮內注射HOXA10反義寡核苷酸后，胚胎植入率顯著下降，也進一步證明了HOXA10在小鼠胚胎植入過程中的重要性。

在人體子宮內膜中，HOXA10和HOXA11的表達是由性激素驅使的，在胚胎植入期出現峰值。在窗口期，雌、孕激素水平升高，通過與子宮內膜上相應的受體結合，激活HOXA10基因的表達，HOXA10參與數以百計基因的調控，這些基因作用于內膜細胞的增殖，間質細胞蛻膜化的發生，內膜分化高峰的形成，使子宮內膜良好容受性得以建立，為胚胎植入提供最佳條件。此外，HOXA10還通過上調子宮內膜間質中色氨酸加氧酶(TDO)的表達來增加色氨酸的代謝，有利于免疫耐受的胚胎植入。因此，HOXA10基因水平可作為衡量子宮內膜容受性建立的基因水平標志物之一。

王麗等[30]的研究表明，使用甲基化轉移酶抑制劑(DNMTI)5-氮雜-2’-脫氧胞苷體外原代培養EMS患者子宮內膜上皮細胞，其HOXA10的甲基化水平顯著下降，同時伴隨HOXA10表達增加，從而進一步調節下游基因的表達，使子宮內膜形成良好容受性。由此證明HOXA10的高甲基化可能是EMS患者HOXA10表達量下調，從而導致內膜容受性受損的潛在表觀遺傳修飾機制之一。

HOXA基因對子宮內膜的作用，具體體現在其作為轉錄因子調控下游靶基因的表達。HOXA10調控的下游因子包括胞飲小泡(pinopodes)、αvβ3整合素(integrins)、胰島素樣生長因子結合蛋白-1(IGFBP-1)、Emx2、P57和FKBP4等，前四者可作為子宮內膜容受性測試和胚胎移植相關的標志物。

4 HOXA10下游基因

HOXA10作為重要的轉錄調節因子，激活或抑制下游靶基因表達，如胞飲小泡、αvβ3整合素、IGFBP-1、Emx2，它們均對子宮內膜良好容受性的建立至關重要。這些因素可以作為特定于著床窗口的分子和形態學標志物。而異常甲基化的HOXA10表達下調，則會使下游因子的調控發生改變，進而影響子宮內膜容受性。

4.1 胞飲小泡 胞飲小泡是腔上皮頂端表面的胞質突起，可以在掃描電子顯微鏡下觀察到，其內含有向管腔延伸的分泌液泡。胞飲小泡表面可能有黏附分子受體，這對胚胎植入至關重要。胞飲小泡內的線粒體和糖原為胚胎發育和囊胚植入提供能量。Diedrich等[31]進行的臨床研究證明，胞飲小泡缺乏患者的胚胎著床率低，而子宮內膜內富含胞飲小泡的女性妊娠成功率高。

胞飲小泡是一種孕激素依賴結構，其出現與窗口期的出現時間一致。移植HOXA10反義基因阻斷HOXA10表達后胞飲小泡的數量顯著減少，而當子宮HOXA10的表達上調時，可以觀察到胞飲小泡增多[32]。因此，胞飲小泡可作為HOXA10介導的子宮內膜功能分化的形態學標記之一。Bartosch等[33]研究了EMS合并不孕癥患者排卵前子宮內膜結構，與對照組相比，光學顯微鏡下患者的腺體數、有核空泡細胞數和基質有絲分裂顯著減少，基于胞飲小泡對胚胎植入的相關作用，提示其與EMS患者子宮內膜容受性相關。以上研究結果表明，EMS可能通過DNA甲基化降低HOXA10基因的表達能力，從而影響胞飲小泡的發育，使EMS患者的子宮內膜容受性降低。

4.2 整合素 整合素是細胞黏附分子家族成員之一，參與細胞間、細胞與基底層之間的黏附作用。它能促進細胞對細胞外基質(ECM)中的蛋白質的黏附，并提高細胞的遷移和侵襲能力。普遍認為整合素通過激活內膜亞單位，使內膜血管通透性增加，促進血管釋放物質作用于子宮內膜，介導細胞與ECM間的黏附，有利于胚胎的植入。許多整合素家族的成員在整個月經周期子宮內膜均有表達。其中，αvβ3整合素在子宮內膜腔上皮細胞頂端的表達格外關鍵，它在胚胎植入期表達，即月經周期第20天后的分泌期，是子宮內膜容受性最佳時期，它在最初胚胎與子宮內膜相互作用中起關鍵作用。吳天思等[34]的實驗結果顯示，EMS模型組小鼠窗口期子宮內膜αvβ3整合素表達量低于假手術組。但是Casals等[35]的研究結果顯示，EMS患者窗口期內膜αvβ3整合素表達水平與輸卵管因素或不明原因不孕組間的差異均無統計學意義。EMS患者窗口期子宮內膜腔上皮細胞頂端αvβ3整合素表達量的變化有待進一步確定。

αvβ3整合素高表達水平與高水平的孕激素及其靶點HOXA10相關。此外，HOXA10可以直接監管整合素β3亞單位的表達，孕激素也可通過HOXA10通路調節整合素β3的表達。整合素β3表達峰值與HOXA10峰值吻合。整合素β3沿子宮內膜腔上皮細胞頂端的增加顯著，從而增強胚胎黏附能力；整合素β3進一步從黏著斑位點除去子宮上皮細胞使胚胎植入。因此，可能由于HOXA10基因的甲基化下調了HOXA10，直接或間接影響了整合素的表達，降低子宮內膜容受性，進而對胚胎的著床產生影響。

4.3 IGFBP-1 IGFBP-1最初被認為是結合并調節胰島素樣生長因子(IGF)-Ⅰ和IGF-Ⅱ的蛋白。人類蛻膜基質細胞表達IGFBP-1。在母胎交界面，蛻膜表達的IGFBP-1與胎兒滋養細胞表達的IGF-Ⅱ之間產生了一種旁分泌相互作用，提供胚胎植入必需的條件。在狒狒和人體子宮內膜間質細胞中，HOXA10通過與FOXO轉錄因子FKHR相互作用，上調IGFBP-1表達，參與了子宮內膜蛻膜化進程[36-37]。Lee等[38]的實驗結果顯示，在EMS小鼠模型中，HOXA10發生甲基化，并且檢測到作為蛻膜化的標志物之一的IGFBP-1表達下調。同時有研究[39]結果顯示，在EMS患者中蛻膜基質細胞分泌的IGFBP-1水平也下降。但是有研究發現，HOXA10上調使患有EMS的狒狒蛻膜細胞IGFBP-1的表達增加。Kim等[37]的實驗證明，使用特定的小干擾RNA(siRNA)寡核苷酸沉默HOXA10后，HOXA10 mRNA表達下降，與對照組相比，IGFBP-1表達明顯增加。該實驗為EMS患者子宮內膜中HOXA10蛋白的減少可能導致內膜細胞在蛻膜過程中IGFBP-1的表達增加提供了一個潛在機制的證據。眾多研究結果顯示，EMA患者IGFBP-1水平存在差異，具體結果還有待進一步研究發現。但以上實驗結果提示，HOXA10的甲基化導致HOXA10蛋白降低，可能成為IGFBP-1表達明顯改變，進而導致內膜容受性下降的機制之一。

4.4Emx2Emx2是人類與果蠅的同源異型盒基因，是首個被證實由HOXA10基因直接參與負向調控的生殖道發育相關因子。Emx2轉錄產物水平在卵泡期顯著上升，至分泌早期達到峰值，但是在胚胎著床期下降半數。抑制Emx2基因表達使子宮內膜細胞增殖、體積增大、發生蛻膜化，以形成胚胎植入的最佳結構基礎。Emx2基因轉染的小鼠產仔數減少40%。EMS患者子宮內膜HOXA10下調而Emx2表達增加，而后伴隨胚胎植入缺陷[40]。由此推斷，可能由于EMS患者植入期子宮內膜HOXA10高甲基化使其表達下調，Emx2表達升高，使子宮內膜容受性受損，不能產生良好的著床環境，從而影響胚胎植入。因此，抑制HOXA10的高甲基化，降低Emx2表達，有望成為今后改善EMS患者內膜容受性的治療靶點之一。

5 相關治療

子宮內膜異常甲基化使PR-B/PR-A比值發生改變，同時HOXA10甲基化也沉默孕激素靶基因作用，均造成孕激素抵抗。孕激素抵抗成為目前治療EMS的難點。患者對生理性或外源性孕激素發生抵抗，導致不孕、流產發生率升高，以及孕激素輔助治療療效不佳。一種選擇性PR調制器藥物Asoprisnil被用來治療孕激素抵抗，但療效參差不齊。

王麗等[30]使用DNMTI 5-氮雜-2’-脫氧胞苷體外原代培養EMS患者子宮內膜上皮細胞，其HOXA10的甲基化水平下降，同時HOXA10表達上調，從而進一步調節下游基因的表達，促進了子宮內膜容受性的建立。

葉酸是人類體內甲基基團的最終來源，在維持DNA甲基化中發揮著不可或缺的作用。許科[41]通過臨床試驗證明，EMS患者體內葉酸水平與HOXA10基因表達呈顯著正相關，因而推測補充葉酸可能作為降低啟動子區甲基化概率，進而促進良好子宮內膜容受性的建立，并阻止EMS發病進程的新方向。

6 結語和展望

子宮內膜容受性的建立作為胚胎植入的關鍵性因素，是EMS合并不孕患者迫切需要的。綜上所述，DNA甲基化本質上是由DNMTs催化的一種可逆的表觀遺傳修飾，其中尤其是PR-B和HOXA的甲基化，可能作為影響EMS患者內膜容受性的重要因素。采用DNMT1抑制異常甲基化的發生，進行基因靶向治療，有望從基因水平使EMS發生轉歸。此外，在DNMT1抑制基因甲基化的過程中，同時調控并改善HOXA10下游相關基因轉錄，使子宮內膜容受性得以重建，從而有利于胚胎著床，提高EMS患者的臨床妊娠率，為EMS患者不孕的治療提供了新的方向。