SIRT1、NF-κB在兒童支氣管哮喘中的作用

趙文峰，黃先杰

哮喘為呼吸系統常見慢性疾病，臨床表現為氣道炎癥、氣道高反應性和吸入性抗原引起的可變氣流阻塞[1]。哮喘可能來自各種致病因子，其分子機制尚未明確[2]。SIRT1(silent information regulator 1,SIRT1)屬于sirtuin蛋白質家族，并已被證明可介導多種細胞事件，包括壽命延長、細胞生長和炎癥[3]。由于哮喘是一種炎癥性疾病，而SIRT1在生理和病理過程中具有抗炎作用，而且也可以修飾很多非組蛋白，包括對NF-κB的去乙酰化作用參與到NF-κB介導的細胞凋亡及炎癥反應中[4]。因此，SIRT1對哮喘的發生和進展具有重要意義。本研究重點探討SIRT1/NF-κB信號通路中SIRT1和NF-κB表達水平，分析其與哮喘發病的關系。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2016年1月至2018年1月在我院接受治療的41例哮喘患兒為觀察組，其中男27例，女14例。年齡3～13(5.84±1.37)歲，均符合兒童支氣管哮喘診斷和分級標準[5]，1周內均未接受激素類藥物的治療，排除合并鼻炎、急性呼吸道感染、肺部疾病、異物以及其他慢性疾病者。來我院參加體檢的健康兒童為對照組，共40例。無近期感染病史，無個人和家族過敏性疾病史，男25例，女15例，年齡3～13(5.68±1.31)歲。兩組患兒的性別、年齡等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 樣本采集及指標檢測患兒入院抽取靜脈血6 mL，分成3份，每份2 mL。其中一份Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，置入液氮罐中保存備用；另一份3 000 r·min-1離心10 min，留取血清，采用酶聯免疫法測定血清IL-6水平，試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司(產品編號PI330)；第三份置EDTA-K2釆血管內，進行Eos計數。

1.3 肺功能指標檢測采用德國耶格小兒肺功能儀檢測第一秒用力呼氣量(forced expiratory volume in 1 second,FEV1)、第一秒用力呼氣量/用力肺活量(forced expiratory volume in 1 second /forced vital capacity,FEV1/FVC)、用力呼氣中期流量(forced expiratory flow,FEF)25%～75%、FEF50%、FEF75%；同時檢測呼出氣NO(fractional exhaled nitric oxide,FeNO)，呼出流速控制在50 mL·s-1。每項指標測定3次，計算平均值。測量前詳細告知兒童及家長注意事項，測量前行容積校準，4歲以上1～3 L定標筒，3歲以下為100 mL定標筒。配合較差的可口服水合氯醛30～50 mg·kg-1，鎮靜催眠。

1.4 SIRT1、NF-κB mRNA的表達Trizol法提取PBMC總RNA，按照試劑盒說明逆轉錄生成 cDNA。采用Agilent M×3000P實時熒光定量PCR儀(Roche Diagnostics，德國)，上海英駿公司合成引物序列。SIRT1(NM_001314049.1)上游序列：5′-ACACAAAATCCAGCAACTCAGC-3′，下游序列：5′-TCCTTTGGATTCCCGCAACC，產物217 bp；NF-κB(Z22949.1)上游序列：5′-GTGTTTCACAC-ACGCACCAG-3′ ，下游序列：5′-ACCCCCTTCCTCC-TATTCAGG-3′T，產物302 bp；β-actin(DQ407611.1)上游序列：5′-CTTCCAGCCTTCCTTCCTGG-3′ ，下游序列：5′-CTTCTGCATCCTGTCGGCAA-3′，產物163 bp。采用相對定量2-△△Ct法比較目的基因水平。

2 結果

2.1 肺功能指標比較觀察組的FEV1、FEV1/FVC、FEF 25%～75%、FEF 50%、FEF 75%較對照組顯著降低，FeNO較對照組顯著增加，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 肺功能指標各組檢測結果

注：FEV1：第一秒用力呼氣量；FVC：用力肺活量；FEF：用力呼氣中期流量；FeNO：呼出氣一氧化氮。

2.2 兩組IL-6和Eos水平比較觀察組的Eos、IL-6水平較對照組均顯著增加，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 IL-6和Eos水平各組檢測結果

注：Eos :外周血嗜酸性粒細胞;IL-6:白細胞介素-6。

2.3 PBMC中SIRT1、NF-κBmRNA的表達與對照組比較，外周血單核細胞中觀察組SIRT1 mRNA水平明顯降低，NF-κBmRNA水平明顯增加，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 SIRT1、NF-κB mRNA的表達

2.4SIRT1、NF-κBmRNA的相關性分析SIRT1 mRNA的表達與FEV1、FEV1/FVC、FEF25%～75%、FEF50%、FE 75%呈正相關(P<0.05)，與FeNO、IL-6和Eos呈負相關(P<0.05)；NF-κBmRNA的表達與FEV1、FEV1/FVC、FEF25%～75%、FEF50%、FEF75%呈負相關(P<0.05)，與FeNO、IL-6和Eos呈正相關(P<0.05)。見表4。

表4 SIRT1、NF-κB mRNA的相關性分析

3 討論

在本研究中，觀察組SIRT1 mRNA水平明顯降低，NF-κBmRNA水平明顯增加，提示SIRT1能調節機體的炎癥反應，并參與調控包括NF-κB等眾多炎癥相關基因的轉錄。而且SIRT1能使NF-κB去乙酰化，抑制NF-κB的過度激活，抑制其轉錄活性，下調基因的表達[6]，這也可能與兒童哮喘的發生和發展有關。

SIRT1也稱為NAD-去乙酰化酶，屬于sirtuin蛋白家族的一個成員[7-8]。SIRT1已被證明可介導多種細胞事件，包括壽命延長、細胞生長、腫瘤細胞侵襲和炎癥[9-10]。由于哮喘是一種炎癥性疾病，已有一些學者研究了SIRT1在哮喘的生理和病理過程中的作用[11]。Ichikawa T等發現，在OVA致敏和攻擊小鼠中，與鹽水致敏和攻擊小鼠(對照小鼠)相比，肺中Sirt1mRNA表達明顯降低，而細胞浸潤，氣道嗜酸粒細胞和支氣管肺泡灌洗(BAL)白細胞介素IL-4、IL-5和IL-13的水平增加，這表明了抗炎作用[12]。此外，Wang Y等還證實了OVA致敏小鼠肺組織中的SIRT1表達減少[13]。本研究結果顯示，哮喘患兒的SIRT1水平較對照組明顯下調，并與肺功能指標呈正相關，而與炎癥介質及FeNO呈負相關。這些提示SIRT1與哮喘兒童的氣道炎癥及反應性存在一定的聯系，可能參與了哮喘的發生和進展。值得注意的是，SIRT1參與了催化NF-κB的去乙酰化，抑制其炎癥功能[14]。NF-κB被鑒定為SIRT1發揮抗炎作用的關鍵效應物，其可通過調節表達水平發揮對應的功能。而SIRT1可以與NF-κB相互作用，負性調節對應基因的表達，從而調控增殖、凋亡、代謝等[15]。本研究結果顯示，哮喘患兒的NF-κB水平較對照組明顯升高，并與肺功能指標呈負相關，與炎癥介質及FeNO呈正相關。這也說明SIRT1可與NF-κB相互作用，并負性調控下游IL-6的水平，同時也提示SIRT1可通過去乙酰化調控NF-κB表達，抑制炎癥水平，延緩哮喘的進展。

總之，下調哮喘患兒SIRT1表達，能抑制NF-κB去乙酰化，并促進IL-6等炎癥介質的表達，誘導哮喘的發生和進展。這些也表明，SIRT1激活可能是治療兒童哮喘的潛在靶點。