胰島素樣生長因子通過磷酸化AKT促進顱咽管瘤細胞增殖

姚 磊，汪俊杰，金思怡，司馬秀田

顱咽管瘤(craniopharyngioma，CP)現在的主流治療手段是手術切除[1]，但術后由于激素的缺少，會引起各種并發癥，術后需要額外補充激素，比如生長激素[2]。一般來說，生長激素會促進胰島素樣生長因子(Insulin-like growth factor，IGF-I)的局部釋放，從而激活IGF-I受體(IGF-I receptor, IGF-IR)。IGF-IR 最初被認為是一種沒有實質性作用的受體，然而在最近幾年已經作為一種具有獨立特征的受體被人們所接受。IGF-IR與細胞的有絲分裂、細胞分化和細胞凋亡有著密切的關系，參與癌癥發生和發展[3]。然而，其在顱咽管瘤中的作用尚不明確，本研究從IGF-1出發探討其在顱咽管瘤細胞增殖中的作用。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 人顱咽管瘤原代細胞體外培養手術中無菌條件下取新鮮、血供好的腫瘤未壞死部分，放入盛有含10%胎牛血清的DMEM/F12中，冰上操作，迅速送至細胞凈化培養室培養。

1.2 形態學觀察倒置相差顯微鏡觀察：將細胞傳代于底部鋪有載玻片的培養皿中，培養24 h，使細胞獲得良好的貼壁，取出載玻片，Trypan染色計數。

1.3 免疫化學染色鑒定顱咽管瘤細胞采用免疫酶染色法對培養的CP腫瘤細胞行角蛋白(CK7)染色，鑒定組織來源，具體操作步驟按說明書進行。應用的一抗為CK7和IGF-IR。結果判讀：隨機選5個高倍鏡視野，記數300個腫瘤細胞，根據著色細胞的數目判定染色結果。參考Kawamato的標準，棕黃色細胞≤30%為陰性，棕黃色細胞數>31%為陽性。

1.4 人顱咽管瘤細胞生物學檢測取指數生長期中的細胞經臺盼藍染色后確定活細胞計數在95%以上，收集細胞，調整密度為1×105·mL-1，接種于6孔培養板中，每孔2 mL，實驗組給予終濃度為100 ng·mL-1的IGF-I。對照組只給相應的培養介質。培養1、3、5和7 d后，采用Trypan法對細胞進行計數，并進行MTT檢測。

1.5 細胞免疫組化檢測p-AKT蛋白表達實驗分為IGF-IR陽性組和陰性組，加用IGF-I 100 ng·mL-1干預5～10 min后進行免疫組化染色，方法同1.3，應用一抗為兔抗p-AKT多克隆抗體。

1.6 統計學分析SPSS 13.0處理數據，定量資料采用t檢驗或者單因素方差分析，定性資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CP細胞形態學觀察及鑒定

2.1.1 倒置相差顯微鏡觀察腫瘤細胞形態基本一致，早期未貼壁時為圓形透亮，體積較大。貼壁后，兩種亞型CP細胞表現有所不同，釉質上皮型腫瘤細胞體積較鱗狀乳頭型腫瘤細胞體積稍小，似菱形狀，排列呈典型的鋪路石樣，如細胞密度低則表現為類似寬體的梭形細胞；鱗狀乳頭型腫瘤細胞呈多角(邊)型改變，細胞連接較緊密，如細胞密度低，則呈圓形或扇形樣伸展。細胞核為圓形或類圓形，體積較大，核∶質約為1∶1，胞質豐富，生長較迅速，見圖1。

A：釉質上皮型腫瘤；B：鱗狀鱗形乳頭型腫瘤(×200)。圖1 CP細胞傳代培養的典型表現

2.1.2 細胞免疫化學鑒定顱咽管瘤細胞以CK7為抗體對細胞進行免疫學鑒定，抗體為胞質表達呈陽性反應，因此，所培養細胞被認定為上皮細胞細胞來源，見圖2。

胞質棕褐色陽性顆粒：A：×200；B：×400。圖2 CP細胞CK7陽性染色

2.1.3 細胞免疫化學檢測IGF-IR的表達結果顯示顱咽管瘤細胞中IGF-IR陽性表達為14例，IGF-IR陰性者15例。病理分類顯示，IGF-IR陽性表達的細胞為釉質上皮型11例和鱗狀乳頭瘤型3例，陽性率為釉質上皮性61.1%和鱗狀乳頭瘤型37.5%，二者比較差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.2 IGF-I對CP細胞增殖的影響

2.2.1 細胞增殖狀態及計數體外給予IGF-I 100 ng·mL-1干預培養后，與對照組相比，培養1、3、5和7 d分別進行細胞計數：干預組明顯增多，差異有統計學意義(P<0.05)。而且，IGF-IR陽性組的細胞計數也明顯多于IGF-IR陰性組的細胞計數，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖3。

×105·mL-1

注：①與正常培養組比較，P<0.05；②與IGF-1R(-)比較，P<0.05。

A：IGF-IR陽性細胞，陽性棕色顆粒定位于細胞膜(SP,×400)；B： IGF-IR陰性的腫瘤細胞(SP,×200)。圖3 免疫組化顯示IGF-IR在CP細胞中的表達

2.2.2 MTT測定結果體外給予IGF-I后，對照組細胞OD值0.122±0.023，實驗組中IGF-IR(+)組細胞OD值0.523±0.012，IGF-IR(-)組細胞OD值0.349±0.015，與對照組相比。實驗組細胞OD值明顯增大，差異具有統計學意義(P<0.05)。IGF-IR(+)組與IGF-IR(-)組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.3 細胞免疫組化檢測p-AKT蛋白的表達p-AKT免疫組化陽性細胞為細胞質和/或細胞核呈棕黃色至棕褐色染色。呈核漿型分布，未見單純胞核著色，染色呈淡黃至棕褐色，以彌漫性分布為主，29例CP細胞在IGF-I干預后p-AKT蛋白陽性表達共25例，表達率為84.50%；未干預組的表達共25例，表達率為41.03%，兩組相比差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

A：在IGF-IR陽性的細胞中p-AKT呈強陽性(+++)，陽性棕色顆粒于細胞膜和細胞質；B：IGF-IR陰性的細胞中p-AKT呈弱陽性(+)反應(SP,×200)。圖4 免疫組化顯示IGF-I干預后CP細胞中p-AKT的表達

3 討論

顱咽管瘤是一種較為罕見的腦瘤，治愈后復發率較高[4]。因其瘤體壓迫腦垂體和下丘腦，在手術后常常需要長期使用胰島素樣生長因子來進行激素治療。但由于顱咽管瘤常常伴隨著高復發率，同時IGF-I已被證實與多種癌癥的發生有關[5-6]，例如乳腺癌和肝癌。IGF-I與顱咽管瘤細胞增殖可能有著密切關系。

作為與胰島素有同源相似性的生長激素代替物，IGF-I在細胞分化中以及細胞凋亡的過程中不可或缺[7]。已經有研究證明，IGF-I在結直腸癌和乳腺癌等的發生中有著一定的作用：結直腸癌患者血清中的IGF-I水平明顯增高，這與IGF-I促進黏附分子的合成有關[8]；IGF-I能刺激正常乳腺上皮細胞生長和腫瘤發生，通過激活磷脂酰肌醇-3激酶途徑，以及通過磷酸化AKT通路促進DNA的合成而使癌細胞增殖[9]。目前，關于IGF-1與顱咽管瘤的關系尚缺少相應的文獻。本研究運用細胞計數和MTT方法檢測IGF-1干預后細胞增殖情況，發現IGF-1可明顯促進細胞增殖。

鑒于磷酸化AKT通路在乳腺癌中的作用[9]，IGF-I可能通過磷酸化AKT通路促進顱咽管瘤細胞的增殖。本研究通過免疫組化檢測細胞中p-AKT蛋白表達程度，結果顯示，IGF-I干預后p-AKT蛋白陽性表達率明顯增加，提示IGF-I可能通過增加p-AKT蛋白的表達促進顱咽管瘤細胞增殖，通過干預p-AKT的表達有望成為未來顱咽管瘤治療新的靶點。

近年來，顱咽管瘤術后康復成為熱門研究方向，但對于影響其康復效果及其復發率的因素的探尋還有限，深入探索新的治療靶點與途徑有助于降低顱咽管瘤的復發率。