芝麻酚調控乳腺癌細胞MCF-7增殖的機理初步研究

蘇龍俊，羅冬平，丁雅芳，林榮霄，伍家發，徐正順

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,我國乳腺癌發病率有逐年增高趨勢,已位于女性癌癥第二位，死亡率則平均每年上升6.9%，且發病年齡早于西方國家10～15 a，呈年輕化趨勢[1]。研究表明乳腺癌發病與膳食密切相關，特別是飲食習慣[2-3]，如膳食中抗氧化成分可能調節體內的氧化應激狀態[4]。有研究發現膳食中抗氧化成分較多的人群患乳腺癌的風險較低[5]。

芝麻酚(3,4-亞甲二氧基苯酚，sesamol)是芝麻油主要的香氣成分和品質穩定劑，具有很強的抑菌和抗氧化活性，是優良的無毒抗氧化劑[6-7]。芝麻酚可作為代謝調節劑，抑制動脈粥樣硬化的進展，降低血漿膽固醇和三酰甘油水平[8-9]，具有抗誘變[10]、抗損傷、抗衰老[11]和化學預防的作用[12]。最近，已經闡明了芝麻的多種生物學功能，例如抑制炎癥和抗癌作用，芝麻酚在小鼠腸癌細胞中通過抑制COX-2轉錄抵抗炎癥[13]，芝麻酚可誘導肝癌細胞(HepG2)[14]、結腸癌細胞(HCT116)[15]、乳腺癌細胞(MCF-7、T47D)凋亡[16]。

芝麻酚影響乳腺癌細胞增殖的研究雖有少量報道，但其作用的分子機理尚不清楚。本文試圖闡明芝麻酚抑制乳腺癌增殖的分子機理，為后續的進一步研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料人乳腺癌MCF-7細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；芝麻酚(CAS：533-31-3，BC grade)購自生工生物工程(上海)股份有限公司，用DMSO配制；碘化丙啶、CCK8試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；RT-PCR所用試劑購自江蘇康為世紀生物科技有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 細胞培養利用RPMI-1640培養液(含10%胎牛血清)培養乳腺癌MCF-7細胞， 37 ℃，CO2體積分數為5%。

1.3 細胞毒性檢測采用CCK8比色法檢測細胞毒性。取對數生長周期的MCF-7細胞，制成單細胞懸液，每孔100 μL(5 000個細胞)接種于96孔板，每組設3個復孔。實驗組：添加不同濃度(0、20、50、100和200 μmol·L-1)芝麻酚，對照組：添加DMSO。培養48 h，換液后加入CKK8溶液10 μL，孵育1 h，以不加細胞只加培養液和CCK8為空白對照，在酶標儀上檢測波長450 nm的吸光度(OD450 nm)。使用GraphPad Prism 5 計算IC50。

1.4 細胞增殖采用CCK8比色法檢測細胞增殖情況。取對數生長周期的MCF-7細胞，制成單細胞懸液，每孔100 μL(2 000個細胞)接種于96孔板，每組設3個復孔。實驗組：添加不同濃度芝麻酚(0、20、50、100和250 μmol·L-1)，對照組：添加DMSO。分別于第1、2、3、4和5 d，換液后加入CKK8溶液10 μL，孵育1 h，以不加細胞只加培養液和CCK8為空白對照，在酶標儀上檢測波長450 nm的吸光度(OD450 nm)。以吸收值為縱坐標，時間為橫坐標繪制細胞生長曲線，并用SPSS 19.0 進行統計分析。

1.5 細胞周期檢測采用PI單染色法檢測細胞周期。按照上述方法進行MCF-7細胞接種，給予芝麻酚(50 μmol·L-1)處理后繼續培養48 h，制成單細胞懸液，離心洗滌后加入PI(50 μg·L-1)溶液和 RNaseA(20 μL·mL-1)，用200目尼龍膜過濾樣品，選488 nm波長在流式細胞儀上檢測并進行細胞周期的分析。

1.6 RT-qPCR檢測利用Trizol試劑盒提取RNA，然后用逆轉錄試劑盒將RNA 逆轉錄為cDNA，利用SYBR-Green試劑進行qPCR反應，反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，40個循環。qPCR引物：p53上游：5’-ATTTGCGTGTGGAGTATTTGGATG-3’，p53下游：5’-CGCCCATGCAGGAACTGTTAC-3’；p21上游：5’-ATGGAACTTCGACTTTGTCACCG-3’，p21下游：5’-CCTGCCTCCTCCCAACTCATC-3’；GAPDH上游：5’-TGGCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，GAPDH下游：5’-TGGTGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。

1.7 統計學方法所得數據采用SPSS 19.0統計軟件處理，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 芝麻酚對乳腺癌細胞MCF-7的IC50采用不同濃度(0、20、50、100和200 μmol·L-1)芝麻酚處理MCF-7細胞，然后采用CCK8比色法檢測細胞毒性。經GraphPad Prism 5 計算IC50為48.91 μmol·L-1。

2.2 芝麻酚對MCF-7細胞增殖的影響采用不同濃度的芝麻酚處理MCF-7細胞，然后通過CCK8試劑盒檢測增殖程度。圖1所示除20 μmol·L-1濃度之外，50、100和250 μmol·L-1的實驗組與對照組相比，抑制程度均具有顯著差異(P<0.05)。

2.3 芝麻酚對細胞周期的影響采用50 μmol·L-1芝麻酚處理細胞，然后用流式細胞儀檢測細胞周期分布情況，如圖2所示，與對照組相比，芝麻酚處理組的S期細胞比例顯著減少(由32.00%降到18.30%)，G0/G1期細胞顯著增加(由34.10%升到50.90%)，結果表明發生G1/S期阻滯。

2.4 芝麻酚對增殖相關基因表達的影響用50 μmol·L-1芝麻酚處理細胞48 h，然后利用RT-qPCR對G1/S期轉換的調控基因(p53、p21)進行檢測，經芝麻酚處理后，p53和p21的表達水平分別上調3.37和2.21倍(P<0.05)。見圖3-4。

圖1 芝麻酚對乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響

圖2 芝麻酚對乳腺癌MCF-7細胞周期的影響

圖3 芝麻酚對p53表達的影響

圖4 芝麻酚對p21表達的影響

3 討論

芝麻酚可以誘導多種腫瘤發生凋亡，如可以通過線粒體等信號途徑誘導結腸癌[15]、皮膚癌[17]、肝癌[14,18]和肺癌[19]細胞發生凋亡。從圖2可以看出，在芝麻酚的作用下，亞二倍體細胞數量顯著增加，表明芝麻酚能夠誘導MCF-7發生凋亡，但是其分子機理有待進一步研究。

芝麻酚還可以抑制乳腺癌[16]細胞的增殖，但其作用的分子機理尚不清楚。p53基因是重要的腫瘤抑制基因，在細胞周期調控中發揮重要作用，DNA損傷導致p53表達水平上升；p53誘導p21的表達，p21基因是Cip家族中的一員，主要對G1期CDKs起抑制作用，從而引發G1/S期阻滯，p53和p21共同構成細胞周期G1期檢驗點。p53同時激活DNA修復，如修復失敗，p53引發細胞凋亡[20-21]。本研究發現，芝麻酚可以引發G1/S期阻滯，芝麻酚能夠顯著上調p53和p21表達，芝麻酚對G1/S期調控基因MYC和CCND1表達沒有顯著影響(結果未顯示)。研究發現，芝麻酚的抗腫瘤活性可能與DNA的相互作用有關，芝麻酚能夠與DNA的小溝相互作用并能夠在細胞核中累積[14]。因此作者推測芝麻酚可能干擾DNA的復制和/或修復過程，進而激活G1期檢驗點，然后p53和p21表達水平上升，導致G1/S阻滯。

此外，芝麻酚的抗腫瘤活性可能與其強大的自由基清除能力有關[10-11]。活性氧(ROS)與腫瘤發生的關系目前仍存在爭議，部分學者認為腫瘤細胞高水平活性氧啟動分裂增殖、存活和代謝適應信號[22]，如用抗氧化藥物(如NAC或NADPH氧化酶抑制劑)減少細胞內活性氧水平可以抑制Kras誘導的成纖維細胞轉化的促有絲分裂信號[23]。另一方面腫瘤細胞通過提高抗氧化能力，避免因嚴重氧化應激導致細胞死亡[24-25]。

除上述抗腫瘤活性外，芝麻酚還參與脂肪和糖代謝的調控過程[26-27]，通過調節ERK、PI3K/AKT和JNK信號轉導途徑來抑制黑色素合成和酪氨酸酶表達[28]，芝麻酚具有抵抗炎癥的功效，在壞死性結腸炎中具有防護的作用[29]。 以上顯示，芝麻酚具有潛在的藥物開發價值。