超分辨質(zhì)譜分析濃香型白酒洋河夢之藍(lán)（手工班）生物活性物質(zhì)的研究

杜 然，郭律均，閆建斌

（清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物信息學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合成與系統(tǒng)生物學(xué)研究中心，北京100084）

白酒是中華民族文明的結(jié)晶，也是我國傳統(tǒng)文化的重要組成部分[1]。它與白蘭地、威士忌、朗姆酒、伏特加和金酒并稱為世界六大蒸餾酒[2]。由于中國白酒采用特有的窖池固態(tài)發(fā)酵和固態(tài)蒸餾等工藝，使白酒不同于世界上其他蒸餾酒，含有極為豐富的微量成分，包括多種對健康有益的生物活性分子，如已報道的愈創(chuàng)木酚[3]、四甲基吡嗪[4]、γ-氨基丁酸[5]等。

洋河夢之藍(lán)(手工班)是洋河集團(tuán)近年來推出的新酒品。其基酒來自明清老窖池，而且采用了低溫入池、低溫發(fā)酵和低溫餾酒的“三低”生產(chǎn)工藝。這些條件利于微生物生長代謝，可產(chǎn)生更多的生物活性物質(zhì)。本研究綜合采用氣相質(zhì)譜和超分辨質(zhì)譜等精密檢測技術(shù)，對其中的生物活性物質(zhì)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)洋河夢之藍(lán)(手工班)中除了含有白酒中常見的生物活性成分，還含有比較特殊的成分蟲草素和圣草酚。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品：洋河夢之藍(lán)(手工班)。

標(biāo)準(zhǔn)品：蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品（Cordycepin，北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司），CAS號為73-03-0，純度≥98%；圣草酚標(biāo)準(zhǔn)品（Eriodictyol，北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司），CAS號為552-58-9，純度≥98%。

檢測儀器：氣相色譜質(zhì)譜儀（TSQ，美國Thermo），DB-WAX 色譜柱(30 m×0.25,0.25 μm)；超高壓液相色譜（UPLC）和Q-Exactive Orbitrap質(zhì)譜儀（Ultimate 3000，Q-Exactive Orbitrap，美國 Thermo），C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱；數(shù)控型磁力加熱攪拌器；SPME手動進(jìn)樣手柄及50 μm DVB/CAR/PDMS(美國Supelco)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 氣相色譜檢測方法

采用頂空固相微萃取對洋河夢之藍(lán)(手工班)進(jìn)行萃取，萃取條件為：取7 mL白酒樣品、2 g氯化鈉(烘干)和1粒攪拌子置于20 mL頂空瓶中，以DVB/CAR/PDMS萃取纖維在45℃恒溫萃取5 min，以1500 r/min轉(zhuǎn)速攪拌萃取20 min后，迅速將萃取纖維插入氣質(zhì)聯(lián)用儀的進(jìn)樣口中以220℃解吸3 min測定。

氣相參數(shù)：載氣為高純氦氣，流速1 mL/min。程序升溫：70℃起始，保持3 min，然后以5℃/min升到150℃保留2 min，再以8℃/min升到230℃保留2 min。質(zhì)譜參數(shù)：傳輸線溫度為250℃，EI源，溫度230℃。電子轟擊能量為70 eV，發(fā)射電流為100 μA，預(yù)四級桿電壓為-7.8 V，采用全掃描模式，掃描范圍35～500 m/z。

1.2.2 液相色譜檢測方法

采用低溫水浴進(jìn)行樣品處理：取500 mL酒樣置于蒸發(fā)皿中，50℃恒溫水浴；在樣品完全蒸干后，用500 μL乙醇-水將皿底樣品復(fù)溶，溶液轉(zhuǎn)移至棕色樣品瓶待測。采用40%（v/w）的乙醇溶液作為空白對照，采用同樣操作后，轉(zhuǎn)移至樣品瓶待測，檢測結(jié)果作為扣除空白值。

液相參數(shù)：Hypersil GOLD C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱；流動相為0.1%甲酸水(A)和0.1%甲酸乙腈(B)；采用梯度洗脫模式，流動相流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣盤溫度4 ℃；進(jìn)樣量5 μL；柱溫40℃。梯度洗脫程序?yàn)椋?%B(0～5 min)，5%～95%B(5～15 min)，95%B(15～20 min)，5%～95%B(20～21 min)，5%B(21～23 min)。質(zhì)譜參數(shù)，鞘氣流量為50 mL/min；輔助氣流量為13 mL/min；毛細(xì)管溫度為300℃；ESI源；掃描范圍正、負(fù)離子模式均為100～1050 m/z。一級掃描分辨率為70000。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采集的氣相色譜質(zhì)譜數(shù)據(jù)，根據(jù)相應(yīng)的色譜峰對應(yīng)的質(zhì)譜圖，采用NIST庫進(jìn)行比對，對其進(jìn)行定性；采集的液相色譜質(zhì)譜數(shù)據(jù)，根據(jù)相應(yīng)的色譜峰對應(yīng)的質(zhì)譜圖，首先采用SIEVE軟件進(jìn)行分子量的提取，確定其精確分子量，進(jìn)一步采用HMDB數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，選取其中正離子模式質(zhì)量精度5 mg/L、負(fù)離子模式質(zhì)量精度10 mg/L范圍內(nèi)物質(zhì)，進(jìn)一步對篩選出的部分物質(zhì)進(jìn)行相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品對照確認(rèn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 夢之藍(lán)(手工班)蘊(yùn)含多種生物活性物質(zhì)

基于質(zhì)譜檢測數(shù)據(jù)的比對結(jié)果，洋河夢之藍(lán)(手工班)檢測出1000余種主要組分，可定性400余種物質(zhì)，其中包括多種生物活性物質(zhì)，除常見的脂肪酸和酯類活性物質(zhì)外，還檢測到多種功能性組分，涵蓋了酚、呋喃、吡嗪、萜和核苷類似物等不同種類。其中，部分活性物質(zhì)的生物功效已獲得初步研究，比如，乙酸、乳酸具有擴(kuò)展血管功能[6-7]；丁酸能保護(hù)腸黏膜并抑制炎癥因子[8]；亞油酸能改善脂代謝[9]；熊脫氧膽酸有出色的利膽功能[10]；亞麻酸及其衍生物具有改善血壓作用[11]；亞油酸乙酯具有降低血液中膽固醇和血脂的作用[12]；醋酸氫化可的松具有抗炎、抗病毒等作用[13]；叔丁基對苯二酚有較強(qiáng)的抗氧化能力[14-15]；愈創(chuàng)木酚具有祛痰止咳作用[3]；呋喃它酮具有廣譜的抗菌能力[16]；四甲基吡嗪具有多種重要的心血管藥理作用[4]；芳姜黃烯具有抗炎和抗腫瘤能力[17]；紫草氰苷具有明顯的抗炎活性[18]；乙酰谷酰胺具有改善腦功能和神經(jīng)功能的作用[19]；1H-異苯并吡喃衍生物具有抗炎和舒張血管等作用[20]。

值得注意的是，我們還檢測到白酒中較為少見的兩種生物活性成分——圣草酚和蟲草素（圖1）。圣草酚主要來源于蕓香科植物的果實(shí)，已有研究顯示，其具有較強(qiáng)的抗氧化效果，并具有降血糖和降血脂功效[21-22]。蟲草素是蛹蟲草中主要的活性成分，是第一個從真菌中分離出來的核苷類抗生素，已有研究顯示，其具有抗腫瘤、抗菌抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基等多種藥理作用，具有良好的臨床應(yīng)用前景[23-26]。這兩種物質(zhì)的檢出，可能與洋河酒曲和窖池的獨(dú)特性有關(guān)。

2.2 圣草酚的鑒定與定量

為了測定洋河夢之藍(lán)(手工班)中的圣草酚含量，我們采用超分辨質(zhì)譜和液相色譜技術(shù)，首先確定了圣草酚標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間等色譜數(shù)據(jù)，篩選出酒樣中可能的圣草酚信號峰，并以標(biāo)準(zhǔn)品建立濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量其中圣草酚的含量。結(jié)果顯示，檢測出的物質(zhì)峰與圣草酚不僅質(zhì)譜圖一致，其保留時間也完全一致（圖2）。采用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行圣草酚含量檢測，結(jié)果顯示，圣草酚含量為1.78 mg/L。

2.3 蟲草素的鑒定與定量

采用同樣的方法對酒樣中的蟲草素信號峰進(jìn)行定性和定量檢測，結(jié)果顯示，檢測出的物質(zhì)峰與蟲草素不僅質(zhì)譜圖一致，其保留時間也完全一致。采用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行蟲草素含量檢測，結(jié)果顯示，蟲草素含量為1.81 mg/L。

3 結(jié)論

本研究顯示，洋河夢之藍(lán)(手工班)中含有的生物活性物質(zhì)蟲草素和圣草酚濃度均達(dá)到mg/L水平。這些功能物質(zhì)的存在，為進(jìn)一步研究洋河夢之藍(lán)(手工班)的健康功效奠定了基礎(chǔ)。

圖1 洋河夢之藍(lán)(手工班)質(zhì)譜圖

圖2 蟲草素和圣草酚液相色譜圖