鳶尾屬部分種質資源遺傳多樣性的SRAP分析

童俊 毛靜 董艷芳

摘要：利用SRAP分子標記對40份鳶尾屬種質資源進行遺傳特性及親緣關系的分析研究，從170個SRAP隨機引物中篩選出條帶清晰、多態性高、重復性好且穩定性強的引物10個，共檢測到168個位點且全部為多態位點，多態性條帶比例為100%，表明供試材料具有豐富的遺傳多態性。各種質之間的DICE遺傳相似系數在0.067～0.740，平均相似系數為0.281。UPGMA聚類分析結果顯示，當遺傳系數為0.265時，可將供試材料分為7個類群。其中，19份德國鳶尾品種聚到一起，扁竹蘭、喜鹽鳶尾、德國鳶尾‘Queen分別各自聚為一類，上海引種的馬藺和寧夏引種的馬藺聚為一類，而內蒙古馬藺則和路易斯安那鳶尾聚到一起，西伯利亞鳶尾、花菖蒲、黃菖蒲和3個德國鳶尾品種聚為一類，主坐標分析所反映的關系和UPGMA聚類圖相似。

關鍵詞：鳶尾屬;SRAP;遺傳多樣性;親緣關系

中圖分類號：S682.1+9? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）04-0088-05

Abstract： Sequence-related amplified polymorphism （SRAP） was used to detect the genetic diversity among 40 Iris L. materials. 10 primers which could produce clear， polymorphic and steady bands， screened out of 170 random primers， which were used and produced 168 bands totally. All of bands were polymorphic（100%）， which indicated that the genetic diversity of Iris L. was rich. The genetic similarity coefficient among the accessions ranged from 0.067 to 0.740， and the average was 0.281. At the point of the similarity coefficient 0.265， all the accessions might be separated into seven groups. 19 accessions of Iris germanica were brought together. Iris confusa Sealy， Iris halophila and Iris germanica ‘Queen were classified separately. Iris lactea Pall. var. chinensis from Shanghai and Ningxia were lumped into the same category， while Iris lactea Pall. var. chinensis from Inner Mongolian and Iris louisiana were lumped together. Iris sibirica， Iris ensata， Iris pseudacorus and three accessions of Iris germanica were lumped into the same category. The results of principal coordinates showed similarity to the UPGMA dendrogram.

Key words： Iris L.; SRAP; genetic diversity; relationship

鳶尾是世界上著名的宿根花卉，品種繁多，葉片優美，花型多樣，花色艷麗，花期較長，具有“宿根皇后”的美譽。鳶尾既可觀花又可觀葉的雙重價值可廣泛用于園林綠化、盆栽及切花等。鳶尾屬是鳶尾科中最大的一個屬，全世界鳶尾野生種約280種，中國約有60個種、13個變種及5個變型，主要分布于西北、西南及東北等地[1，2]。因受到數量與觀賞性的制約，這些原種在世界各地園林中用于栽培觀賞的卻不多，真正在園林中廣泛應用的是鳶尾園藝品種。目前鳶尾園藝類群包括根莖類無髯鳶尾、根莖類有髯鳶尾和球根鳶尾。其中球根鳶尾一般用于切花生產，在園林中較為少見。有髯鳶尾花型和花色最為豐富，是歐美園林中最為盛行的一類鳶尾。而無髯鳶尾生態類型一般為濕生或中生型，適應性相對較廣，隨著現代育種工作的開展，鳶尾品種也日漸豐富，逐漸受到人們的青睞，其中以西伯利亞鳶尾、日本鳶尾和路易斯安那鳶尾等最為著名[3]。

國內外一直在積極開展鳶尾屬植物系統分類學、細胞發育學、繁殖生物學、分子生物學及植物化學等多方面的研究，采用分子標記和序列分析等手段分析鳶尾屬植物的系統發育學與種類親緣關系也是現代鳶尾屬植物研究的新焦點。牟少華等[4]對中國鳶尾屬植物的地理分布、種質資源保存狀況及園林應用情況進行了概述，并提出了今后研究的4個主要方向。張敏等[5]對鳶尾屬國內分布的25個野生鳶尾種（變型、變種和居群）和6個國外分布種的37份材料進行了遺傳分析，利用ISSR分子標記對德國鳶尾種內部分的栽培品種間進行了遺傳分析檢測，得到的多態性位點百分率為99.7%。

SRAP技術由于多態性好，穩定重復性好，操作簡便，廣泛運用于遺傳多樣性、遺傳穩定性和遺傳分化及親緣關系等[6-9]，此前SRAP標記僅見于對鳶尾屬植物中新疆喜鹽鳶尾的研究[10]。本試驗利用SRAP分子標記對武漢市農業科學院林業果樹研究所收集的德國鳶尾、路易斯安那鳶尾、西伯利亞鳶尾、日本鳶尾花菖蒲的一些栽培品種和國內的部分鳶尾屬野生資源開展多樣性評價及親緣關系的分析，以期為鳶尾屬植物的遺傳改良和種質創新工作提供科學指導和理論依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試鳶尾屬材料共40份（表1），主要是從北京、南京、上海及荷蘭等地引進的鳶尾屬良種，包括德國鳶尾、路易斯安那鳶尾、西伯利亞鳶尾、日本鳶尾花菖蒲的一些栽培品種和國內的部分鳶尾屬野生資源。全部材料種植于武漢市農業科學院林業果樹研究所武湖科技園鳶尾資源圃內。

1.2? DNA提取

植物總DNA提取以鳶尾嫩葉為材料，從同一供試種質的不同單株上摘取3 g幼嫩葉片混合，洗凈晾干剪碎混合后于液氮中研磨，采用改良CTAB法提取葉片總DNA[11]。總DNA經RNaseA酶解純化后，用等體積的氯仿和異戊醇（體積比為24∶1）混合液抽提。用無水乙醇沉淀后溶于TE，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的分子質量并根據熒光強度確定DNA濃度，將DNA濃度調到20 ng/μL待用。

1.3? SRAP檢測

選取葉片纖維發達程度不同的鳶尾材料3份，從170對SRAP引物中篩選出條帶清晰、多態性高、重復性好且穩定性強的引物10個，引物均由英駿生物技術有限公司合成（引物序列見表2）。Taq DNA聚合酶購自Thermo Scientific公司。在對鳶尾屬植物SRAP分析及PCR擴增體系優化后，確定反應總體積為20 μL，其中Taq DNA聚合酶1 U、10×PCR Buffer 2 μL、1.5 mmol/L的氯化鎂、0.2 mmol/L dNTP、0.25 μmol/L上游引物、0.25 μmol/L下游引物、20 ng模板DNA，其余用無菌水補充。

SRAP-PCR采用復性變溫法，開始95 ℃變性3 min，反應前7個循環94 ℃ 1 min，35 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min條件下運行，之后37個循環為94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循環結束后，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產物在2%的瓊脂糖凝膠中電泳，85 V電壓，電泳100 min，溴化乙錠染色后在凝膠成像儀上觀察并照相記錄。

1.4? 數據分析

PCR擴增產物的電泳位置在凝膠的某個相同遷移率位置上有DNA條帶記為1，無DNA條帶記為0。利用NTSYS-PC軟件計算種質間DICE遺傳相似系數，采用SHAN程序中的UPGMA法進行聚類分析，構建聚類圖。采用DCENTER程序對相似系數矩陣進行轉換，再用EIGEN程序進行主坐標分析得出二維圖。

2? 結果與分析

2.1? SRAP擴增多態性分析

由表2可知，10個SRAP隨機引物在供試材料中共擴增出168條帶，全部條帶均為多態性條帶，多態性條帶比例為100%，說明供試鳶尾屬材料之間具有豐富的遺傳多態性。各引物擴增的DNA帶數在13～21條，平均每個引物擴增條帶數和檢測的SRAP多態性的平均數都為16.8，說明供試鳶尾屬植物間的異質性較高，遺傳基礎差異較大。部分引物擴增出的基因組DNA指紋圖譜見圖1。

2.2? 遺傳多樣性分析

基于SRAP分子標記的40份鳶尾種質的DICE相似系數介于0.067～0.740，平均相似系數為0.281。其中，德國鳶尾‘Tiny Charm（材料11）和引種自寧夏馬藺3號（材料40）的相似系數最小，為0.067，表明兩者親緣關系最遠，前者為有髯鳶尾，后者為無髯鳶尾。而花菖蒲3號和花菖蒲4號（分別為材料37和材料38）的相似系數最大，為0.740，表明這兩個品種親緣關系最近，遺傳相似程度最高。

2.3? 聚類分析

用NTSYS-PC軟件對40份鳶尾種質資源進行聚類分析并構建出分子系統樹（圖2），從聚類圖上可以反映出物種間親緣關系的遠近。為了便于分析，在聚類圖的遺傳距離0.265處劃結合線，將供試鳶尾屬的40份材料劃分為7個類群。其中Ⅰ群有19份材料，全部為須毛狀附屬物亞屬的德國鳶尾。Ⅱ群由無附屬物亞屬的扁竹蘭單獨聚為一類。Ⅲ群有10份材料，包括西伯利亞鳶尾、花菖蒲、黃菖蒲和3個德國鳶尾品種。Ⅳ群由上海引種的馬藺和寧夏引種的馬藺聚為一類。Ⅴ群由喜鹽鳶尾單獨聚為一類。Ⅵ群由路易斯安那鳶尾和內蒙古引種的馬藺聚為一類。Ⅶ群由德國鳶尾‘Queen單獨聚為一類。

2.4? 主坐標分析

為了更好地反映材料間的親緣關系，進行主坐標分析，如圖3所示。主坐標二維圖所反映的關系和UPGMA聚類圖的基本相似。以橫坐標軸-0.00處將圖3分為兩半，左邊全部為德國鳶尾（對應圖2的Ⅰ群），其中中高生德國鳶尾品種分布在左下部，矮生德國鳶尾品種分布在左上部。路易斯安那鳶尾和內蒙古引種的馬藺集中分布在右下角（對應圖2的Ⅵ群），其他西伯利亞鳶尾和花菖蒲分布在右上部（對應圖2的Ⅲ群）。扁竹蘭、兩個馬藺、喜鹽鳶尾和德國鳶尾‘Queen分布在中間（分別對應圖2的Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ群）。

3? 小結與討論

本試驗的40份材料包括德國鳶尾、路易斯安那鳶尾、西伯利亞鳶尾、日本鳶尾的一些栽培品種和國內的部分鳶尾屬野生資源。其中，有髯鳶尾原產歐洲中部和南部地區，主要是由有髯鳶尾亞屬有髯鳶尾組的原種雜交獲得，其品種異常豐富，一般認為德國鳶尾是有髯鳶尾重要雜交親本之一。西伯利亞鳶尾原產中歐和亞洲，是所有鳶尾中適應性最廣和抗病蟲害能力最強的一個類群。日本鳶尾又常稱為花菖蒲，是指原產于日本，由玉蟬花雜交選育所獲得的一個鳶尾類群。路易斯安那鳶尾是對無髯鳶尾亞屬路易斯安那鳶尾系雜交品種的統稱，該系大部分原種均原產自美國路易斯安那地區，故得此名。10個有效引物共檢測到168個位點且全部為多態位點，多態性條帶比例為100%。SRAP分子標記本身具有多態性高的特點，這個結果與童俊等[12]利用ISSR分子標記對34個鳶尾屬園藝品種開展遺傳多樣性研究檢測得到的多態性位點百分率（100%）結果一致，從而表明SRAP和ISSR兩種標記技術對鳶尾屬種質資源的遺傳多樣性的分析具有較高的一致性，也進一步證實了供試鳶尾種質資源具有較高的遺傳多樣性。

依據10個有效引物所產生的168個SRAP標記為表征性狀所建立的鳶尾40份種質資源UPGMA聚類圖，將鴦尾40份種質資源劃歸為7個類群，其中Ⅰ群有19份材料，全部為須毛狀附屬物亞屬的德國鳶尾。Ⅱ群由無附屬物亞屬的扁竹蘭單獨聚為一類。Ⅲ群有10份材料，包括西伯利亞鳶尾、花菖蒲、黃菖蒲和3個德國鳶尾品種。Ⅳ群由上海引種的馬藺和寧夏引種的馬藺聚為一類。Ⅴ群由喜鹽鳶尾單獨聚為一類。Ⅵ群由路易斯安那鳶尾和內蒙古引種的馬藺聚為一類。Ⅶ群由德國鳶尾‘Queen單獨聚為一類。40份材料的平均相似系數為0.281。其中，德國鳶尾‘Tiny Charm和寧夏引種的馬藺相似系數最小，表明兩者親緣關系最遠。而花菖蒲3號和花菖蒲4號的相似系數最大，表明這兩個品種親緣關系最近。花菖蒲3號和花菖蒲4號均為花菖蒲的栽培品種，僅花色不同。

遺傳多樣性和種質間親緣關系的研究，不僅與種質資源的收集、保存和更新密切相關，而且是種質資源創新和品種改良的基礎。物種的遺傳多樣性程度是物種長期進化的產物，物種遺傳多樣性越高，表明種質資源在DNA分子水平存在差異越大，對環境變化的適應能力就越強，越容易擴展其分布范圍和開拓新的環境，可供進一步選擇、保存和利用的空間就越大。種質間的親緣關系較近，說明其來源于共同的祖先種的可能性大，在DNA分子水平的差異較小，種質間含有的相同基因的概率高，可供選擇和利用的余地就小。由此，本研究利用SRAP分子標記的方法，在分子水平揭示所收集的鳶尾屬種質資源的親緣關系，結合形態特征和園藝特性，就可以進一步在遺傳多樣性高的群體篩選和保留種質，同時為進一步新品種選育提供優質的親本材料，提高保存和利用種質的效率。

參考文獻：

[1] 趙毓棠.中國植物志[M].北京：科學出版社，1985.

[2] 趙毓棠.鳶尾欣賞與栽培利用[M].北京：金盾出版社，2005.

[3] 胡永紅，肖月娥.濕生鳶尾——品種賞析、栽培及應用[M].北京：科學出版社，2012.

[4] 牟少華，郄光發，彭鎮華，等.我國鳶尾屬植物種質資源的研究與利用[J].草業科學，2007，24（8）：21-24.

[5] 張? 敏，黃蘇珍.鳶尾屬部分植物種質資源的ISSR分析[J].南京農業大學學報，2008，34（5）：58-62.

[6] 廖芳蕾，陳民管，桑? 丹，等.佛手種質資源遺傳多樣性的ISSR分析[J].園藝學報，2013，40（11）：2222-2228.

[7] 葉要妹.利用RAPD和ISSR分析百日草自交系間的種質遺傳多樣性[J].中南林業科技大學學報，2008，28（4）：36-41.

[8] 宋? 明，劉? 婷，湯青林，等.芥菜種質資源的RAPD和ISSR分析[J].園藝學報，2009，36（6）：835-842.

[9] 孫明偉，袁素霞，徐有明，等.基于SRAP標記的百合部分種及品種遺傳結構分析[J].園藝學報，2011，38（8）：1498-1506.

[10] 王瑞芬.利用SSR和SRAP分子標記對新疆喜鹽鳶尾居群遺傳多樣性的研究[D].烏魯木齊：新疆農業大學，2010.

[11] 李承哲，劉占林，楊紅超，等.改良CTAB法提取鳶尾屬植物DNA[J].現代農業科技，2011（8）：31，34.

[12] 童? 俊，周? 媛，毛? 靜，等.鳶尾屬部分園藝品種遺傳多樣性的ISSR分析[J].北方園藝，2015（10）：104-107.