基于網絡藥理學的補腎益髓膠囊治療多發性硬化機制研究

李康寧 王蕾 于佳佳 樊永平

摘要：目的 ?應用網絡藥理學方法分析補腎益髓膠囊主要組成藥物的核心組分及治療多發性硬化可能的分子作用機制，為中藥復方研究提供參考。方法 ?檢索中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP）收錄的補腎益髓膠囊主要組成藥物（熟地黃、連翹、大黃、益母草、浙貝母）的化學成分，進行吸收、分布、代謝、排泄（ADME）分析，預測化合物對應的作用靶點。以口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18或節點度≥5篩選核心化合物，采用Cytoscape3.2.0構建核心化合物-靶點網絡，篩選多發性硬化相關靶點及對應化合物信息。運用STRING數據庫構建靶蛋白互作網絡，并進行KEGG信號通路富集和GO功能富集。結果 ?篩選出核心組分23種、疾病相關靶點43個、GO生物過程229個、代謝通路54條。結論 ?補腎益髓膠囊治療多發性硬化主要從調節炎癥因子、生長因子，調節細胞免疫，促進髓鞘、軸突再生等方面發揮作用，具有多成分、多靶點的特點，與多條信號通路存在直接或間接關系，是多因素誘導的綜合效應。

關鍵詞：補腎益髓膠囊;多發性硬化;網絡藥理學;核心組分;靶點

中圖分類號：R255.6;R285 ???文獻標識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）05-0098-07

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.05.021 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Objective To explore the core components of Bushen Yisui Capsules and the possible molecular mechanism of treating multiple sclerosis by using network pharmacology; To provide references for research on compound TCM. Methods The main components of Bushen Yisui Capsules （Rehmannize Radix Praeparata， Forsythiae Fructus， Rhei Radix et Rhizoma， Leonuri Herba， and Fritiliariae Thunbergii Bulbus） were retrieved from TCMSP for ADME （absorption， distribution， metabolism， excretion） analysis， and target corresponding compounds were predicted. Core compounds with OB ≥ 30%， DL ≥ 0.18， or nodality ≥ 5 were screened. The core compound-target network was constructed using Cytoscape 3.2.0 to screen multiple sclerosis-related targets and corresponding compound information. STRING database was used to construct a target protein interaction network， and KEGG signaling pathway enrichment and GO function enrichment were conducted. Results Totally 23 core components， 43 disease-related targets， 229 GO biological processes， and 54 metabolic pathways were screened out. Conclusion Bushen Yisui Capsules for the treatment of multiple sclerosis mainly plays a role in regulating inflammatory factor and growth factors， regulating cellular immunity， promoting myelin and axon regeneration， and has multi-component and multi-target characteristics. The mechanism has a direct or indirect relationship with multiple signaling pathways， which is the combined effect of multi-factor induction.

Keywords： Bushen Yisui Capsules; multiple sclerosis; network pharmacology; core components; target

多發性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種免疫介導的中樞神經系統炎性脫髓鞘疾病，我國MS患者以中青年為主，臨床以反復發作、緩解與復發并存為特征，致殘率及復發率高，預后不佳。2018年5月22日，MS被納入國家衛生健康委員會等五部委聯合發布的《第一批罕見病目錄》，充分表明MS日漸受到社會各方面的重視。經多年臨床實踐，我們認為MS多以腎虛血瘀痰阻為基本病機，屬中醫學“痿證”范疇，進而確立補益肝腎、祛瘀化痰的基本治法，并創立了補腎益髓膠囊[1-2]。補腎益髓膠囊組成藥物為生地黃、熟地黃、制何首烏、浙貝母、天麻、連翹、酒大黃、益母草、水蛭、全蝎。臨床研究發現，補腎益髓膠囊可明顯改善神經功能缺失癥狀，減少復發，減輕激素或免疫抑制劑的不良反應[1]。目前對中藥復方的研究方法很多，大致分為化學研究、靶點研究和基于系統生物學的研究3種模式。網絡分析方法的提出為研究多組分、多靶點協同的中藥藥理機制提供了新思路。本研究采用網絡藥理學分析方法探索補腎益髓膠囊核心組分及分子作用機制。

1 ?資料與方法

檢索中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP）中補腎益髓膠囊組成藥物。該數據庫目前僅提供了熟地黃、浙貝母、連翹、大黃、益母草這5種藥物的數據信息，我們委托TCMSP團隊對方中另5種藥物生地黃、制何首烏、天麻、全蝎、水蛭的化合物成分進行數據挖掘分析，發現生地黃、制何首烏、天麻的主要化合物成分與上述5種藥物主要化學成分有較多重合，尤其是君藥熟地黃和生地黃存在高度的相似性。而全蝎和水蛭屬于動物類藥，異源蛋白和氨基酸成分較多，故將這類成分舍棄不用。綜合考慮，用熟地黃、浙貝母、連翹、大黃、益母草的主要成分可基本涵蓋整個組方。

因此選取上述5種藥物為研究對象，檢索數據庫收載的成分，并利用TCMSP靶點預測模型預測可能的作用靶點。應用Cytoscape3.2.0構建補腎益髓膠囊主要組成藥物的化合物-靶點網絡，網絡圖中的節點表示化合物分子、靶蛋白，邊表示化合物分子和靶蛋白之間的關系，度越大表明該節點與其他節點連接的緊密性越高、位置越重要、越容易成為核心節點。利用network analyzer分析網絡特征。對各成分進行吸收、分布、代謝、排泄（ADME）分析，參考參數包括重均分子量（MW）、親油性（AlogP）、氫鍵供體（Hdon）、氫鍵受體（Hacc）、口服生物利用度（OB）、血腦屏障（BBB）、類藥性（DL）等。以OB≥30%、DL≥0.18或節點度≥5為條件篩選核心化合物。將節點度≥5的靶點建立靶點-疾病網絡，找出與MS直接相關靶點，對應找出核心化合物-靶點網絡中與上述靶點相對應的化合物，加上核心化合物-靶點網絡中度數≥16的化合物，共同組成候選核心組分。

應用STRING數據庫構建靶蛋白互作（PPI）網絡分析候選核心組分對應靶點間的相互作用，設置“Homo Sapiens（人類）”進行操作，其余參數保持默認設置。以PPI網絡連線的粗細代表互相作用的強弱，靶點的度表示互相作用的靶點個數。通過對KEGG信號通路富集和GO功能富集分析，詮釋候選核心組分的主要代謝通路、生物過程和基因信息，分析補腎益髓膠囊治療MS可能的分子作用機制。

2 ?結果

2.1 ?核心化合物

檢索得到熟地黃、制何首烏、浙貝母、連翹、大黃、益母草包含的化合物分別為76、17、150、92、51個。ADME分析得到核心化合物分子性質見表1。

2.2 ?核心化合物-靶點網絡

共收集補腎益髓膠囊主要化合物239種進入化合物-靶點網絡分析。經OB、DL及節點度篩選，共得到核心化合物88種，其中58種化合物有相應的靶點信息，節點度≥8的核心化合物見表2。構建補腎益髓膠囊核心化合物-靶點網絡，得到357個節點、980條邊，見圖1。

2.3 ?核心化合物靶點-疾病網絡

選擇核心化合物-靶點網絡節點度≥5的靶點進行靶點-疾病網絡分析，得到相關靶點57個，其中43個靶點在數據庫中有相應的疾病信息，構建靶點-疾病，得到223個節點、256條邊，見圖2。

2個靶點直接與MS相關，分別是peroxisome proliferator activated receptor gamma（238號）、beta-2 adrenergic receptor（766號）。與238號相關的化合物包括quercetin（槲皮素）、kaempferol（堪非醇）、wogonin（漢黃芩素）、isorhamnetin（異鼠李素）、pelargonidin（天竺葵苷元）、（2R，3R，4S）-4-（4-hydroxy-3- methoxy-phenyl）-7-methoxy-2，3-dimethylol-tetralin-6-ol;與766號相關的化合物包括quercetin、wogonin、beta-sitosterol（β-谷甾醇）、stigmasterol（豆甾醇）、arctigenin（牛蒡子苷元）、（2R，3R，4S）-4-（4-hydroxy-3- methoxy-phenyl）-7-methoxy-2，3-dimethylol-tetralin-6-ol、（3R，4R）-3，4-bis[（3，4-dimethoxyphenyl）methyl]oxolan-2- one、galeopsin（鼬瓣花二萜）、（+）-pinoresinol monomethyl ether（（+）-松脂醇單甲醚）、（-）-phillygenin（（-）-連翹苷元;連翹脂素）、preleoheterin（前益母草乙素）、secoisolariciresinol（開環異落葉松脂素）、arctiin（牛蒡子苷）、（+）-pinoresinol monomethyl ether-4-D-beta- glucoside_qt（（+）-松脂醇單甲醚-4-D-beta-糖苷）、FORSYTHINOL（連翹醇）、Zhebeiresinol（浙貝素）。

2.4 ?補腎益髓膠囊候選核心組分篩選

選擇網絡度≥16的核心化合物及與MS相關的靶點所對應的主要化合物，由此確定候選核心組分的研究范圍：quercetin、kaempferol、luteolin（毛地黃黃酮）、ursolic acid（熊果酸）、wogonin、beta-sitosterol、arachidonic acid（花生四烯酸）、isorhamnetin、stigmasterol、bicuculline（荷包牡丹堿）、aloe-emodin（蘆薈大黃素，蘆薈瀉素）、arctigenin、rutin（蘆?。?、astragalin（紫云英苷）、EUPATIN（澤蘭黃醇素）、pelargonidin（天竺葵苷元）、galeopsin（鼬瓣花二萜）、（-）-phillygenin、preleoheterin、Secoisolariciresinol、arctiin、FORSYTHINOL、Zhebeiresinol，共23種。

2.5 ?候選核心組分相關靶蛋白互相作用網絡

23種候選核心組分對應靶點建立的PPI網絡共包含253個節點、4753條邊，平均節點度數37.6，其中5個節點與其他節點無相互關系，故納入248個節點進行分析，見圖3。18種蛋白的網絡連接度>100，參數信息見表3，節點度≥80的主要靶點見圖4。

2.6 ?候選核心組分KEGG代謝通路

錯誤發現率（FDR）<0.05的代謝通路163條，排除與神經系統無關通路，54條可能與候選核心組分藥效機制相關，其中Neuroactive ligand-receptor interaction、Neurotrophin signaling pathway與神經系統功能密切相關。基因數排序見圖5，通路信息見表4。

2.7 ?候選核心組分相關GO功能富集分析

FDR<0.05的GO生物過程共229個，根據參與生物過程包含的基因數排列。其中分子功能（基因數195）、結合（基因數189）、蛋白結合（基因數152）、離子結合（基因數130）、催化活性（基因數108）等生物過程有較多靶蛋白參與。GO功能富集生物過程基因數排序見圖6。前20個生物過程見表5。

3 ?討論

補腎益髓膠囊（又名“二黃方”“二黃膠囊”），具有補益肝腎、祛瘀化痰功效，前期研究表明其可明顯改善神經癥狀、減輕激素不良反應、降低近期復發率，明顯改善MS患者的生存質量[1]。補腎益髓膠囊能上調MS急性期患者腦脊液轉化生長因子（TGF）-β1[2]，還可通過下調血漿中腫瘤壞死因子（TNF）-α、上調IL-12 p40的表達發揮作用[3]，這與候選核心組分靶蛋白PPI網絡篩選結果相吻合，且TNF-α、TGF-β1節點度數均較高，表明在分子機制中貢獻較大。發病高峰期和恢復期NK細胞和多種細胞因子含量變化還提示補腎益髓膠囊可能通過調節NK細胞、IL-6發揮治療作用[4]。補腎益髓膠囊可上調實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）大鼠中樞神經系統TGF-β免疫組織化學表達，促進疾病恢復，并可顯著降低腦和脊髓組織γ-干擾素（IFN-γ）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）表達，療效優于激素[5]。此外，還可上調EAE大鼠血漿IL-4水平[6]及下調急性期血漿TNF-α水平[7]，對EAE模型大鼠NK細胞有一定的調節作用[8]，EAE小鼠神經功能評分較模型組明顯降低，腦組織炎性浸潤程度減輕，恢復期NK細胞明顯增加[9]。候選核心組分相關靶蛋白PPI網絡中IL-6、MMP-9、IL-4、IFN-γ節點度均較高。KEGG代謝通路分析發現，Natural killer cell mediated cytotoxicity是PPI網絡的重要通路之一，這與前期研究發現補腎益髓膠囊對NK細胞的調節作用相一致。大量生長因子參與神經系統的修復和再生過程，故篩選出的TGF-β1、血管內皮生長因子（VEGF）A、表皮細胞生長因子（EGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）2相關度均較高。上述研究結果提示補腎益髓膠囊可能通過調節炎癥因子、生長因子和細胞免疫功能發揮神經保護作用。

PPI網絡中Neuroactive ligand-receptor interaction、 Neurotrophin signaling pathway 2個信號通路與神經系統功能密切相關。通過檢索KEGG數據庫中的通路信息發現，Neurotrophin signaling pathway包含PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway、p53 signaling pathway、NF-κB signaling pathway等通路的主要功能基因，通過調節細胞凋亡、生長、分化起到促進軸突生長、神經再生的作用。補腎益髓膠囊可明顯增加腦源性神經營養因子（BDNF）在EAE小鼠腦內的表達，可能通過促進BDNF表達而起到神經保護作用[10]，BDNF正是Neurotrophin signaling pathway的關鍵蛋白。另外，與神經功能恢復密切相關的軸突導向通路包含了KEGG富集的MAPK signaling pathway、Wnt signaling pathway等主要功能基因，有利于軸突生長和再生，為神經功能修復提供條件。

在靶點-疾病網絡中，靶點peroxisome proliferator activated receptor gamma和Beta-2 adrenergic receptor直接與MS相關。Peroxisome proliferator activated receptor gamma主要通過抑制小膠質細胞和星形膠質細胞活化[11]、保護少突膠質細胞前體細胞[12-13]、抑制中樞神經系統炎癥因子分泌[14]等起到神經保護的作用，治療MS常用的過氧化物酶體增殖物激活受體激動劑通過NF-κB signaling pathway、Jak-STAT signaling pathway等通路發揮神經調節作用。而Beta-2 adrenergic receptor參與MS的炎性脫髓鞘和軸突變性，在發病過程中起到重要作用。

中藥復方并不等同于幾味藥或幾種化合物成分的簡單相加，而是一個綜合作用體系。目前整體研究處于瓶頸階段，黑箱理論無法得到更好的研究結果。本研究為理論層面嘗試，希望找到可靠途徑分解分析大復方。靶點-疾病網絡顯示不同疾病具有共同的病理變化，可被同一復方治愈，即1個復方可對應多種疾病。將系統藥理學方法引入中藥配伍分析，能快速確定復方活性成分，揭示藥物間的協同互作關系。本研究通過靶點網絡分析得出補腎益髓膠囊治療MS的主要作用機制與多條信號通路均相關，是多因素誘導的綜合效應，各信號通路既互相獨立，又互相聯系，形成復雜的協同效應。上述結果與中醫藥治療疾病的整體觀念一致。中藥是一個多成分的復雜體系，通過網絡藥理學和生物信息學研究，有助于探討補腎益髓膠囊治療MS的作用機制，為后續分子機制研究和實驗設計提供依據;通過篩選，可精簡復雜中藥復方，為新藥研發提供參考。

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（收稿日期：2018-09-22）

（修回日期：2019-01-13;編輯：向宇雁）