炎寧糖漿質量標準研究

周楠 武佳麗 曲范娜 張清波 孟云閣 孫小萌 筆雪艷

摘要：目的 ?提高炎寧糖漿的質量標準，有效控制制劑質量。方法 ?采用薄層色譜法對炎寧糖漿中白花蛇舌草、鹿茸草進行定性鑒別，采用HPLC測定去乙酰車葉草酸甲酯的含量，建立HPLC指紋圖譜分析方法。結果 ?薄層色譜鑒別分離度高、專屬性強、重現性好;含量測定指標去乙酰車葉草酸甲酯在0.08～0.8 μg范圍內呈良好的線性關系（r=1.000），平均回收率為104.68%，精密度RSD=0.89%，重復性RSD=0.55%;經采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》對指紋圖譜進行分析，標定了33個共有峰，確認4個峰分別為原兒茶酸、去乙酰車葉草酸甲酯、香草酸、咖啡酸，對10批炎寧糖漿進行相似度評價，其相似度均高于0.85。結論 ?本方法簡單準確、專屬性強，可為提高炎寧糖漿質量標準提供依據。

關鍵詞：炎寧糖漿;白花蛇舌草;鹿茸草;去乙酰車葉草酸甲酯;薄層色譜法;高效液相色譜法;指紋圖譜

中圖分類號：R284.1 ???文獻標識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）05-0083-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.05.018 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Objective To improve the quality standard of Yanning Syrup and control the qulity of preparation. Methods The thin-layer chromatography method was used to conduct qualitative identification for Hedyotis diffiisa and Monochasma sheareri in Yanning Syrup. HPLC was used to measure the content of deacetyl asperulosidic acid methyl ester. The HPLC fingerprint analysis method was established. Results The method of the thin layer chromatographic condition was good enough. And the method was special and reproducible. The linear of deacetyl asperulosidic acid methyl ester was in the range of 0.08–0.8 μg （r=1.000）. The average recovery rate was 104.68%， RSD of precision was 0.89%， RSD of reproducibility was 0.55%. Besides， Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprints of TCM was used to analyze and compare the fingerprints. Totally 33 common peaks were determined and four were calibrated including protocatechuic acid， deacetyl asperulosidic acid methyl ester， vanillic acid and caffeic acid. The similarity were all over 0.85 for 10 batches of Yanning Syrup. Conclusion The method is simple， accurate and specific， which can provide a reasonable basis for the improvement of quality standard of Yanning Syrup.

Keywords： Yanning Syrup; Hedyotis diffiisa; Monochasma sheareri; deacetyl asperulosidic acid methyl ester; TLC; HPLC; fingerprints

炎寧糖漿由鹿茸草、白花蛇舌草、鴨跖草3味藥組成，具有清熱解毒、消炎止痢功效。鹿茸草為玄參科植物沙氏鹿茸草的干燥地上部分，收載于2008年版《上海市中藥飲片炮制規范》[1]，含有苯乙醇苷、黃酮、有機酸及多糖等成分[2]，具有清熱解毒、涼血止血、除濕止痛、抑菌抗炎、抗癲癇及保護心肌的功效[3-4]。白花蛇舌草為茜草科植物白花蛇舌草的干燥全草，收載于2012年版《黑龍江省中藥飲片炮制規范與標準》[5]，含有萜類、黃酮、多糖、生物堿及氨基酸等成分[6]，具有清熱解毒、散結消痛、抗菌消炎、抗腫瘤、抗氧化的功效[7-8]。鴨跖草為鴨跖草科植物鴨跖草的干燥地上部分，收載于2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）[9]，具有清熱消炎、抗病毒、鎮痛、抗高血糖及抑菌的功效[10-11]。炎寧糖漿現收載于2015年版《中華人民共和國藥典》（一部），鑒別項為化學反應法和以熊果酸為對照的薄層鑒別法，含量測定為紫外分光光度法測定總黃酮含量[9]。現行標準在實際薄層鑒別中熊果酸與齊墩果酸難以分離，含量測定采用紫外可見分光光度法測定總黃酮干擾項較多。為更有效控制制劑質量，本試驗修改白花蛇舌草的薄層色譜鑒別，并增加鹿茸草的薄層色譜鑒別，采用HPLC測定白花蛇舌草中去乙酰車葉草酸甲酯的含量，以咖啡酸為參照峰，建立HPLC指紋圖譜分析方法。

1 ?儀器與試藥

1260型HPLC儀，包括DAD檢測器（美國Agilent公司）;2695型HPLC儀，包括2998PDA檢測器（美國Waters公司）;XS205型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）;DXA252薄層色譜數碼成像系統（杭州漢澤科技有限公司）;Agilent C18色譜柱（4.6 mm×250 mm），Venusil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm），Kiomosil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm）;TLC用硅膠G板（青島海洋化工廠）;聚酰胺薄膜（臺州市路橋四甲生化塑料廠）。

炎寧糖漿，黑龍江康隆藥業有限公司，批號分別為1610001、1610002、1610003、1607001、1607002、1607003、1701003、1701004、1704001、1701001，依次編號為S1～S10;白花蛇舌草、鹿茸草、鴨跖草，黑龍江康隆藥業有限公司，批號160701，經黑龍江省食品藥品檢驗檢測所筆雪艷鑒定為白花蛇舌草、鹿茸草、鴨跖草正品;白花蛇舌草對照藥材（批號121028- 200507）、咖啡酸對照品（批號110855- 201210）、原兒茶酸對照品（批號110809-200604）、蘆丁對照品（批號100080-201408）、去乙酰車葉草酸甲酯對照品（批號111786-201602），中國食品藥品檢定研究院;乙腈、甲醇為色譜純，美國Honeywell公司;乙醇、氯仿、冰醋酸為分析純，國藥集團化學試劑有限公司;超純水，自制。

2 ?方法與結果

2.1 ?定性鑒別

2.1.1 ?白花蛇舌草

取炎寧糖漿10 mL，加硅藻土適量拌勻，干燥，加乙醇30 mL，靜置12 h，過濾，濾液濃縮至約2 mL，制成供試品溶液。取白花蛇舌草對照藥材1 g，加水30 mL，加熱回流1 h，放冷，過濾，濾液濃縮至約15 mL，加乙醇30 mL，靜置12 h，過濾，濾液濃縮至約2 mL，制成對照藥材溶液。按處方量折算制成缺白花蛇舌草的炎寧糖漿，同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法[2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）通則0502]試驗，吸取上述供試品溶液10 μL、對照藥材溶液5 μL、陰性對照溶液10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（5∶1.5∶0.1）的下層溶液為展開劑展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。

2.1.2 ?鹿茸草

取炎寧糖漿5 mL，加水20 mL稀釋，用乙酸乙酯萃取4次，每次25 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。按處方量折算制成缺鹿茸草的炎寧糖漿，同法制成陰性對照溶液。稱取咖啡酸對照品適量，加甲醇制成1 mg/ mL的對照品溶液。照薄層色譜法[2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）通則0502]試驗，吸取上述溶液各2 μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以36%乙酸為展開劑展開，取出，晾干，置紫外燈光下（365 nm）檢視。供試品色譜在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。

2.2 ?含量測定

2.2.1 ?色譜條件與系統適用性

色譜柱：Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;柱溫：30 ℃;流動相：乙腈-水（4∶96，V/V）;流速：1.0 mL/min;檢測波長：237 nm;進樣量：5 μL。在上述色譜條件下，以去乙酰車葉草酸甲酯峰計理論塔板數≥8000，分離度>1.5。色譜圖見圖1。

2.2.2 ?對照品溶液的制備

取去乙酰車葉草酸甲酯對照品適量，精密稱定，加4%乙腈制成含去乙酰車葉草酸甲40 μg/mL的溶液，即得。

2.2.3 ?供試品溶液的制備

取炎寧糖漿5 mL，置于25 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，過濾，取續濾液，即得。

2.2.4 ?陰性對照溶液的制備

按處方量并以相同制劑工藝制備缺白花蛇舌草的陰性樣品，按“2.2.3”項下方法制成陰性對照溶液。

2.2.5 ?線性關系考察

精密吸取“2.2.2”項下對照品溶液2、5、10、15、20 μL，按“2.2.1”項下色譜條件測定，以進樣量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=7.237 5X-3.200 0（r=1.000），去乙酰車葉草酸甲酯在0.08～0.8 μg范圍內線性關系良好。

2.2.6 ?重復性試驗

取同一批樣品（批號1607001），按“2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定并計算含量，去乙酰車葉草酸甲酯峰面積RSD=0.55%，表明本法重復性較好。

2.2.7 ?精密度試驗

取去乙酰車葉草酸甲酯對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積，去乙酰車葉草酸甲酯峰面積RSD=0.89%，表明本方法精密度良好。

2.2.8 ?穩定性試驗

按“2.2.3”項下方法平行制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件分別于0、4、8、16、24 h測定，去乙酰車葉草酸甲酯峰面積RSD=1.34%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.9 ?加樣回收率試驗

精密量取已知含量的炎寧糖漿（批號1607001）供試品6份，每份2.5 mL（含去乙酰車葉草酸甲酯0.367 1 μg），精密加入去乙酰車葉草酸甲酯對照品溶液適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，計算回收率，結果見表1。

2.2.10 ?耐用性試驗

考察不同品牌十八烷基鍵合硅膠色譜柱（Aglilent C18、Kiomosil C18、Venusil C18）、柱溫對色譜圖的影響。按“2.2.1”項下色譜條件對供試品溶液和對照品溶液進行測定，記錄色譜圖，結果樣品色譜峰分離度、理論塔板數均能滿足要求，耐用性良好。

2.2.11 ?樣品含量測定

按上述方法制備供試品溶液，測定10批炎寧糖漿中去乙酰車葉草酸甲酯含量，每批平行測定2份，結果見表2。

2.3 ?指紋圖譜

2.3.1 ?色譜條件

色譜柱：Venusil C18（4.6 mm×100 mm，5 ?m）;流動相：乙腈（A）-0.5%乙酸水溶液（B），梯度洗脫（0～4 min，0%A;4～25 min，0～13%A;25～30 min，13%A;30～40 min，13%～17%A;40～62 min，17%～36%A;62～80 min，36%～57%A）;流速：0.9 mL/min;柱溫：35 ℃;檢測波長：250 nm（0～40 min），350 nm（40.1～60 min），250 nm（60.1～80 min）;進樣量5 μL。

2.3.2 ?對照品溶液的制備

精密稱取咖啡酸對照品適量，加甲醇配制成含咖啡酸0.2 mg/mL對照品溶液;精密稱取去乙酰車葉草酸甲酯對照品適量，加4%乙腈制成含去乙酰車葉草酸甲酯40 μg/mL對照品溶液;精密稱取原兒茶酸對照品適量，加70%甲醇配制成含原兒茶酸0.1 mg/mL對照品溶液;精密稱取香草酸對照品適量，加70%甲醇配制成含原兒茶酸0.2 mg/mL對照品溶液。

2.3.3 ?供試品溶液的制備

精密量取本品5 mL，加水定容至50 mL容量瓶中，搖勻，0.45 ?m微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.3.4 ?精密度試驗

取同一批供試品溶液（批號167001），按“2.3.1”項下色譜條件連續進樣6次測定，記錄色譜圖，以咖啡酸色譜峰為參照峰，對各共有峰相對保留時間及相對峰面積進行計算，并利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》計算相似度。結果相對保留時間RSD為0.02%～0.30%，相對峰面積RSD為0.3%～2.56%，均小于3.0%，表明本方法精密度良好。

2.3.5 ?穩定性試驗

取同一批供試品溶液（批號167001），按“2.3.1”項下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12、18、24進樣測定，各主要色譜峰相對保留時間RSD為0.02～0.22%，相對峰面積RSD為0.49%～2.86%，均小于3.0%。利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》計算相似度，結果穩定性相似度均大于0.98，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.6 ?重復性試驗

取平行制備的同一批號炎寧糖漿（167001）6份，按“2.3.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。結果主要色譜峰的相對保留時間RSD為0.02%～0.23%，均小于2.0%;相對峰面積RSD為0.53%～4.70%。利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》計算相似度，結果重復性相似度均大于0.98，表明本方法重復性良好，符合指紋圖譜的要求。

2.3.7 ?共有峰及參照色譜峰的建立

取10批炎寧糖漿樣品，按“2.3.3”項下方法制成供試品溶液，并取咖啡酸、去乙酰車葉草酸甲酯、原兒茶酸、香草酸對照品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進行分析，得到各樣品HPLC指紋圖譜，結果見圖2。利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》軟件確定了33個共有峰，并計算其相似度，結果見表3。利用對照品比對進行共有峰指認，通過對比保留時間和DAD光譜圖，確認13號峰為原兒茶酸，14號峰為去乙酰車葉草酸甲酯，20號峰為香草酸，21號峰為咖啡酸，其中咖啡酸峰分離度好、響應值適中、相對峰面積較大，故以咖啡酸作為參照色譜峰。

3 ?討論

本研究在炎寧糖漿原質量標準基礎上，增加了白花蛇舌草和鹿茸草的專屬性鑒別，以及對白花蛇舌草中去乙酰車葉草酸甲酯的含量測定。去乙酰車葉草酸甲酯為白花蛇舌草主要的萜類成分之一，具有紫外吸收，易于檢測，且在常用中藥中均未發現，因此選去乙酰車葉草酸甲酯作為質量控制的指標性成分有較好的專屬性[12]。

白花蛇舌草對照藥材的薄層色譜鑒別，分別考察了三氯甲烷-乙醚（5∶1）、三氯甲烷-甲醇-水（5∶1.5∶0.5）、三氯甲烷-乙醇-濃氨試液（7.5∶7.5∶0.1）等多個展開系統，最終確定了三氯甲烷-甲醇-水（5∶1.5∶0.5）為展開劑的薄層色譜條件。

鹿茸草含有大量咖啡酸，在鹿茸草的薄層色譜鑒別中，考察了乙酸丁酯-甲酸-水（7∶2.5∶2.5）、36%乙酸展開系統，后者的展開效果明顯優于前者。此外，將鹿茸草水煎液按“2.1.2”項下方法制備，供試品與鹿茸草在相應位置上有多個相同顏色斑點，且無陰性干擾。但由于無市售的鹿茸草對照藥材，故仍將咖啡酸鑒別定為鹿茸草的鑒別方法。

去乙酰車葉草酸甲酯的含量測定試驗中，經DAD全波長掃描，在237 nm具有最大吸收波長，因此確定檢測波長為237 nm。根據去乙酰車葉草酸甲酯的理化性質和色譜行為，考察了水溶解、水飽和正丁醇萃取、乙酸乙酯萃取、D101大孔樹脂洗脫制成供試品溶液，結果表明，水直接稀釋的供試品溶液保留時間適中、分離度好且峰面積較大，為保證樣品含量測定結果的真實有效性，最終選擇水溶解進樣。

在炎寧糖漿指紋圖譜研究中，本研究對乙腈- 0.2%甲酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.4%磷酸水溶液、乙腈-0.4%乙酸水溶液、乙腈-0.5 %乙酸溶液作為流動相體系進行了考察，結果表明，應用乙腈-0.5%乙酸水溶液系統洗脫可使炎寧糖漿樣品得到較好的分離。分別于流速0.8、0.9、1.0 mL/min條件下對炎寧糖漿樣品的指紋圖譜進行測定，結果顯示，流速為0.9 mL/min時，各成分分離效果較好，基線較平穩，故選擇流速為0.9 mL/min。

參考文獻：

[1] 上海市食品藥品監督管理局.上海市中藥飲片炮制規范[M].上海：上海科學技術出版社，2008：328.

[2] 崔言坤，楊世林，許瓊明，等.鹿茸草中3種苯乙醇苷的分離制備工藝研究[J].中草藥，2017，48（2）：288-293.

[3] 鄉世健，潘林燕，王婉菱，等.鹿茸草抗炎、止咳作用的初步研究[J].時珍國醫國藥，2012，23（11）：2727-2728.

[4] 鄭巍，郭良君，孔飛飛.鹿茸草提取物抗癲癇作用的實驗研究[C]//中華醫學會臨床藥學分會2014年全國學術會議論文匯編，2014：1.

[5] 黑龍江省食品藥品監督管理局.黑龍江省中藥飲片炮制規范及標準[M].哈爾濱：黑龍江科學技術出版社，2012：100.

[6] 于亮，王芳，郭琪，等.白花蛇舌草的化學成分及其藥理活性研究進展[J].沈陽藥科大學學報，2017，34（12）：1104-1114.

[7] WANG N， LI D Y， NIU H Y， et al. 2-hydroxy-3-methylanthraquinone from Hedyotis diffusa Willd induces apoptosis in human leukemic U937 cellsthrough modulation of MAPK pathways[J]. Arch Pharm Res， 2013，36（6）：752-758.

[8] 紀寶玉，范崇慶，裴莉昕，等.白花蛇舌草的化學成分及藥理作用研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20（19）：235-240.

[9] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015：282，1107.

[10] 王興業，李劍勇，李冰，等.中藥鴨跖草的研究進展[J].湖北農業科學， 2011，50（4）：652-655.

[11] 王垣芳，楊美子，李祖成，等.鴨跖草對高脂血癥小鼠血脂代謝及抗氧化能力的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（16）：273-277.

[12] 范崇慶，李嬈嬈，金艷，等.白花蛇舌草質量標準[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20（17）：98-101.

（收稿日期：2018-08-29）

（修回日期：2018-09-19;編輯：陳靜）