青光安有效組分對(duì)兔青光眼術(shù)后濾過(guò)道瘢痕組織中膠原纖維、成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1表達(dá)的影響

蔣鵬飛 黃學(xué)思 彭俊 李苑碧 喻娟 彭清華

摘要：目的 ?觀察青光安4種有效組分對(duì)兔青光眼術(shù)后濾過(guò)道瘢痕組織中膠原纖維、成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1（FSP-1）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）表達(dá)的影響，對(duì)比青光安4種有效組分及青光安混懸液抗濾過(guò)道瘢痕化的效果。方法 ?采用青光眼濾過(guò)手術(shù)制作動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)兔按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白組（A組）、模型組（手術(shù)對(duì)照組，B組）、絲裂霉素C組（C組）、有效組分1組（D組）、有效組分2組（E組）、有效組分3組（F組）、有效組分4組（G組）和青光安混懸液組（H組）。各給藥組給予相應(yīng)藥物。觀察各組兔濾過(guò)道瘢痕組織中膠原纖維、FSP-1、CTGF、TGF-β1水平。結(jié)果 ?術(shù)后C、E、H組兔眼壓回升緩慢，眼壓值較術(shù)前和A組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;膠原纖維面積比值除B、D、G組外，其他各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;FSP-1表達(dá)除B、G組外，其他各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;CTGF表達(dá)除B、D、G組外，其他各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;TGF-β1表達(dá)除B、G組外，其他各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 ?青光安有效組分2、絲裂霉素C及青光安混懸液通過(guò)抑制膠原纖維、FSP-1、CTGF、TGF-β1的表達(dá)，降低肌成纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖，從而減少濾過(guò)道瘢痕組織的增生，有明顯抗青光眼術(shù)后濾過(guò)道瘢痕化的作用，青光安有效組分2和青光安混懸液抑制濾過(guò)道瘢痕化效果基本相當(dāng)。

關(guān)鍵詞：青光安有效組分;青光眼;濾過(guò)道瘢痕化;膠原纖維;成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1;結(jié)締組織生長(zhǎng)因子;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1;兔

中圖分類號(hào)：R285.5 ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ???文章編號(hào)：1005-5304（2019）05-0059-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.05.013 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Objective To observe the effects of effective components of Qingguang'an on collagen fibers， fibroblast-specific protein-1 （FSP-1）， connective tissue growth factor （CTGF） and transforming growth factor-β1 （TGF-β1） in rabbits after glaucoma surgery; To compare the four effective components of Qingguang'an and the effects of Qingguang'an suspension on scarring of filtration passage. Methods Glaucoma filtering surgery was used to make animal models. The rabbits were randomly divided into blank group （group A）， model group （surgical control group， group B） and mitomycin C group （group C）， effective component 1 group （group D）， effective component 2 group （group E）， effective component 3 group （group F）， effective component 4 group （group G） and Qingguang'an suspension group （group H） according to body weight. Each administration group was given relevant medicine. The levels of collagen fibers， FSP-1， CTGF and TGF-β1 in the scar tissue of rabbit filtration passage in each group were observed. Results After surgery， the intraocular pressures of group C， E and H were slow， with statistical significance ?compared with preoperation and group A， （P<0.05）. The area ratio of collagen fibers was statistically significant ?except for the comparison among group B， D and G （P<0.05）. The expression of FSP-1 was statistically significant among the other groups except for the comparison between group B and group G （P<0.05）. The expression of CTGF was statistically significant among the other groups except for the comparison among group B， D and G （P<0.05）. The expression of TGF-β1 was statistically significant among the other groups except for the comparison between group B and G group （P<0.05）. Conclusion Effective component 2 in Qingguang'an， mitomycin C and Qingguang'an suspension can reduce the proliferation of myofibroblasts and fibroblasts by inhibiting the expressions of collagen fibers， FSP-1， CTGF and TGF-β1， and show obvious anti-glaucoma scarring effect after filtration. The efficacy of effective component 2 in Qingguang'an and Qingguang'an suspension for inhibiting the scarring of the filtration passage is basically the same.

Keywords： effective components of Qingguang'an; glaucoma; filtration scarring; collagen fibers; fibroblast- specific protein-1; connective tissue growth factor; transforming growth factor-β1; rabbits

青光眼致盲率高，目前治療方式主要是進(jìn)行濾過(guò)性手術(shù)，而濾過(guò)道瘢痕化是濾過(guò)性手術(shù)失敗最主要的原因。盡管抗代謝藥物如絲裂霉素C在手術(shù)中應(yīng)用大大提高了手術(shù)成功率，但此類藥物廣泛作用于眼部組織，會(huì)導(dǎo)致濾過(guò)泡滲漏、眼內(nèi)感染等一系列并發(fā)癥，易給患者本來(lái)已損傷的視功能帶來(lái)新的威脅[1-2]。本課題組自主研制的青光安顆粒劑具有活血化瘀、利水明目的功效，用于術(shù)后抗濾過(guò)道瘢痕化療效顯著[3-5]。前期通過(guò)在青光安顆粒劑中藥組分庫(kù)中建立高通量篩選藥物體系[6-7]，已篩選出4種青光安有效組分。本實(shí)驗(yàn)將4種青光安有效組分、青光安混懸液及絲裂霉素C應(yīng)用于手術(shù)動(dòng)物模型，觀察各組兔濾過(guò)道瘢痕組織中膠原纖維、成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1（FSP-1）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）的表達(dá)及抑制瘢痕組織增生的效果，對(duì)比各有效組分抗濾過(guò)道瘢痕化的實(shí)際療效，為研制治療青光眼的藥物提供依據(jù)。

1 ?實(shí)驗(yàn)材料

1.1 ?動(dòng)物

SPF級(jí)新西蘭長(zhǎng)耳白兔48只，湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體質(zhì)量1.5～2.0 kg，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)前排除雙眼及全身病變。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房，溫度（23±2）℃，相對(duì)濕度50%～55%，自由攝食飲水。

1.2 ?藥物

水合氯醛，上海國(guó)藥集團(tuán);絲裂霉素C，上海士鋒生物科技有限公司，貨號(hào)A1400;青光安4種有效組分，湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥化學(xué)教研室;青光安（黃芪、赤芍、地龍、車前子、白術(shù)、茯苓等）顆粒，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供，用滅菌蒸餾水配制成混懸液。

1.3 ?主要試劑與儀器

4%多聚甲醛，武漢博士德生物工程有限公司;兔抗人成纖維細(xì)胞特異性蛋白單克隆抗體，武漢賽維爾生物科技有限公司，批號(hào)GB11397;兔抗人結(jié)締組織生長(zhǎng)因子單克隆抗體，武漢賽維爾生物科技有限公司，批號(hào)GB11078;兔抗人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子單克隆抗體，武漢賽維爾生物科技有限公司，批號(hào)GB11271;SABC即用型試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)SA1022;DAB試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)SA2025。超低溫冰箱（中科美菱，DW-HL538），立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，YXQ-LS-SⅡ），凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司，SW-CJ-1D），電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司，101-1AB型），低溫臺(tái)式高速離心機(jī)（赫西儀器裝備有限公司），超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Nanodrop公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），微量移液器（德國(guó)Eppendorf公司），臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司），水平電轉(zhuǎn)槽（北京六一儀器廠，DYCP-40C），超純水儀（美國(guó)Millipore公司），紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海Spectrum公司，SP-752），恒溫?fù)u床（常州金壇，THZ-82A），水平搖床（北京六一儀器廠，WD-9405B），掃描儀（日本Canon）。

2 ?實(shí)驗(yàn)方法

2.1 ?分組

實(shí)驗(yàn)兔按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白組（A組）、模型組（手術(shù)對(duì)照組，B組）、絲裂霉素C組（C組）、有效組分1組（D組）、有效組分2組（E組）、有效組分3組（F組）、有效組分4組（G組）和青光安混懸液組（H組），每組6只。

2.2 ?造模

10%水合氯醛溶液（2～4 mL/kg）兔耳緣靜脈注射麻醉，使用壓陷式眼壓計(jì)測(cè)每只兔術(shù)眼3次眼壓，取平均值并記錄。生理鹽水沖洗術(shù)眼結(jié)膜囊后滴0.1%丁卡因進(jìn)行局部麻醉，在手術(shù)顯徼鏡下行雙眼小梁切除+虹膜根部切除術(shù)[8]。

2.3 ?給藥

A、B組術(shù)后第l日開始給予生理鹽水灌胃;C組術(shù)中切除鞏膜和小梁組織前給予絲裂霉素C;D、E、F、G組術(shù)后第1日開始給予青光安不同組分，按體表面積折算等效劑量比值計(jì)算給藥，溶于生理鹽水;H組術(shù)后第1日開始給予成人臨床等效劑量3.27倍青光安混懸液，溶于生理鹽水。給藥體積均為10 mL/kg，每日1次，連續(xù)4周。

2.4 ?術(shù)后眼壓測(cè)量及取材

眼壓參照文獻(xiàn)[8]方法測(cè)量。灌胃4周后第1日取材，空氣栓塞法處死兔，立即摘取眼球4%多聚甲醛固定[6]，剪取手術(shù)區(qū)10 mm×10 mm范圍內(nèi)的方形全層眼球壁及其周邊組織，石蠟切片，備行Masson染色。

2.5 ?膠原纖維、成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的表達(dá)檢測(cè)

取4份石蠟切片Masson染色，1份光鏡400倍視野下隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，觀察膠原纖維占視野面積比值，另外3份各隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野分別測(cè)量FSP-1、CTGF、TGF-β1的平均光密度值。

3 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 ?結(jié)果

4.1 ?青光安有效組分對(duì)模型兔眼壓的影響

同一時(shí)間不同組眼壓情況：手術(shù)后各組眼壓均明顯下降，且手術(shù)后1周內(nèi)各組均有抑制眼壓的效果;手術(shù)后2周B、G組眼壓基本恢復(fù)到術(shù)前水平;手術(shù)后4周C、E、F、H組手術(shù)效果依然存在，該4組所用藥物對(duì)術(shù)后抑制眼壓上升均有一定效果，其中以C組效果最好，F(xiàn)組較差。同一組不同時(shí)間段眼壓情況：B組術(shù)后2、4周與術(shù)前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明B組手術(shù)2周后眼壓基本恢復(fù)到術(shù)前水平;C組術(shù)后各時(shí)間段與術(shù)前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明C組在手術(shù)后眼壓均處于較低水平;D組術(shù)后4周較術(shù)前差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明D組對(duì)抑制眼壓上升無(wú)明顯作用;E組術(shù)后各時(shí)間段相比術(shù)前差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明E組對(duì)抑制眼壓上升有效;F組術(shù)后各時(shí)間段較術(shù)前差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明F組對(duì)抑制眼壓上升有效;G組術(shù)后各時(shí)間段較術(shù)前差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明G組對(duì)于抑制眼壓上升有效;H組術(shù)后各時(shí)間段較術(shù)前差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明H組對(duì)抑制眼壓上升有效。結(jié)果見(jiàn)表1。