蛋白組學(xué)在肝癌中的應(yīng)用研究

袁佳慧

摘?要：近年來，人們在基因組學(xué)的研究上有了巨大的進(jìn)展，如研究者利用宏基因組學(xué)克隆技術(shù)篩選獲得全新的功能基因和活性物質(zhì)，大大促進(jìn)了醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)工程的快速房展以及人類基因組測序中每條染色體的DNA分子大小，包含的編碼基因、非編碼基因和假基因的數(shù)目，編碼基因的舉例。然而基因的表達(dá)是有選擇性的，生命體的所有生命現(xiàn)象都是由蛋白質(zhì)去執(zhí)行完成的，所以在人們對生命現(xiàn)象研究的過程中，蛋白質(zhì)已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)，而蛋白組學(xué)就是研究蛋白質(zhì)的有力方法，因此蛋白組學(xué)已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。將通過查閱文獻(xiàn)的方式對蛋白組學(xué)在肝癌方面的研究方法及進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)與展望。

關(guān)鍵詞：蛋白組學(xué)的研究;肝癌中的應(yīng)用

中圖分類號：F24?????文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A??????doi：10.19311/j.cnki.1672-3198.2019.14.045

蛋白組學(xué)是指大規(guī)模研究蛋白質(zhì)的特征，其中包括蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾、蛋白質(zhì)之間的相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上疾病發(fā)生的機(jī)理、細(xì)胞代謝等過程的認(rèn)識的一門學(xué)科。近年來，隨著蛋白組學(xué)研究技術(shù)的不斷發(fā)展，蛋白組學(xué)已被應(yīng)用于很多領(lǐng)域，例如在疾病研究中發(fā)現(xiàn)新的標(biāo)志物、探索遺傳病的發(fā)病原因、為更快更好的研制藥物提供技術(shù)支持、對食品科學(xué)提供新思路，同時(shí)對于微生物界的研究也有很廣的應(yīng)用。其中，蛋白組學(xué)應(yīng)用于人類疾病的研究最為廣泛，例如的肝癌的研究。目前，肝癌是最常見的疾病，有較高的發(fā)病率，致死率很大，并且呈現(xiàn)上升趨勢。因此，有研究者將蛋白組學(xué)應(yīng)用于肝癌的研究中。

1?蛋白組學(xué)技術(shù)

1.1?蛋白質(zhì)的沉淀

蛋白質(zhì)的分離技術(shù)在不斷地改進(jìn)與創(chuàng)新中。研究蛋白質(zhì)的分離可以為之后蛋白質(zhì)的鑒定提供較優(yōu)的原材料?，F(xiàn)在常見的有鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法。而有機(jī)溶劑相比中性鹽來說，機(jī)溶劑沉淀法的分辨力和提純效果比鹽析法更好。

1.1.1?鹽析法

鹽析法是操作較為簡便的一種沉淀蛋白質(zhì)的技術(shù)，將中性鹽加入在蛋白質(zhì)溶液中，中性鹽將破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜來沉淀蛋白質(zhì)。雖然操作簡便、可以保護(hù)蛋白質(zhì)、適用范圍也較廣，但是它的缺點(diǎn)也很多，例如提純濃度不高，無法得到足夠純度的蛋白質(zhì)。例如張煜先利用硫酸鹽鹽析法分級分離大豆酸沉蛋白，再用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行分析，最終得出了此方法操作簡單，可在短時(shí)間內(nèi)使不同大小的酸沉蛋白沉淀出來。

1.1.2?有機(jī)溶劑沉淀法

有機(jī)溶劑沉淀法相比于鹽析法來說，分辨力更高一些，提純效果要更好一些。因?yàn)橛袡C(jī)溶劑不僅可以破壞蛋白質(zhì)表面的水合層，而且有機(jī)溶劑還可以使中性離子間的靜電引力增強(qiáng)，這樣蛋白質(zhì)就會(huì)沉淀下來。但有機(jī)溶劑法仍不能得到足夠純度的蛋白質(zhì)，需要后續(xù)的加工，另外蛋白質(zhì)也易由變性，有機(jī)溶劑的極大使用也會(huì)帶來回收、儲存的麻煩。有機(jī)溶劑沉淀也廣泛的應(yīng)用，如張恭勤，張一新，謝維剛等提取無蛹突蛋白質(zhì)。將含有豐富蛋白質(zhì)的蠶蛹曬干、破碎、去皮，再用有機(jī)溶劑反復(fù)沉淀蛋白質(zhì)，得到了大量無蛹臭的白色蠶蛹蛋白質(zhì)。

1.2?蛋白質(zhì)的分離純化

蛋白質(zhì)的分離技術(shù)是不斷改進(jìn)和發(fā)展的，最開始利用簡單的離心技術(shù)，雖然能在一定程度上對物質(zhì)進(jìn)行分離，但僅利用物理方法無法實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的徹底分離，分離后仍混有較多雜質(zhì)，而蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)要求較精確，所以蛋白質(zhì)的分離技術(shù)不斷向更準(zhǔn)確、更精確的方向發(fā)展。目前主要的分離技術(shù)有離心法，電泳法以及色譜技術(shù)等。

1.2.1?離心法

在這些技術(shù)中比較簡單的方法是離心法，離心技術(shù)是通過離心力來分級蛋白質(zhì)。此方法雖操作簡便、快速，但無法完全分離各組分，如陳如梅等人應(yīng)用離心的方法獲得球蛋白提取液。一般，離心法無法將物質(zhì)完全分離，處理后產(chǎn)物仍混有較多雜質(zhì)，需要在離心后采用其他技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步分離。

1.2.2?高效液相色譜法

高效液相色譜法的原理是用液體作為流動(dòng)相搭配高壓輸液系統(tǒng)，在色譜柱中裝入混合溶劑，緩沖液等流動(dòng)相。再抽離柱內(nèi)成分后進(jìn)行檢測，從而分離樣品，如高旭東利用高效液相色譜檢測黃芩苷，鹽酸小檗堿和大黃素;色譜法在目前能較好分離蛋白，并且具有較高的分離效率、分析速度、檢驗(yàn)靈敏度和較少的樣品用量、較好的選擇性，易于自動(dòng)化。張?jiān)返壤酶咝б合嗌V法鑒定柑橘果實(shí)中18種類黃酮的含量時(shí)，說明了此方法的優(yōu)缺點(diǎn)，缺點(diǎn)即不能進(jìn)行相關(guān)蛋白質(zhì)的具體檢測。

1.2.3?雙向電泳

同時(shí)利用蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量的差異進(jìn)行電泳分離的方法叫雙向電泳法，第一向是等電聚焦電泳，第二向是SDS—PAGE電泳。之后的蛋白質(zhì)呈現(xiàn)二維分布，水平方向是蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)上的差異，垂直方向上是蛋白質(zhì)分子量上的差異。這個(gè)方法具有高靈敏度和高分辨率，方便的圖像分析處理與質(zhì)譜分析匹配的優(yōu)點(diǎn);但這種技術(shù)對于有些蛋白質(zhì)還難于有效分離、梯度不穩(wěn)定，并且膠內(nèi)酶解過程即費(fèi)時(shí)、又費(fèi)力，又使這項(xiàng)技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。例如沈飛英等人用雙向電泳技術(shù)研究家蠶催青前期的胚胎蛋白質(zhì)，檢測到家蠶催青前期的467個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。

1.3?蛋白質(zhì)的鑒定

將蛋白質(zhì)分離出來后，要對其進(jìn)行鑒定。目前主要的蛋白質(zhì)鑒定方法為和蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)，下面將重點(diǎn)介紹這兩種方法。

1.3.1?雙向電泳

利用蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量的差異進(jìn)行電泳分離的方法叫雙向電泳法。雙向電泳的分離圖像可以對組織蛋白質(zhì)表達(dá)的分子量和等電點(diǎn)等進(jìn)行初步鑒定，并可以預(yù)測蛋白質(zhì)點(diǎn)出現(xiàn)的位置。例如譚永梅等利用雙向電泳技術(shù)有效的分析了冠突散囊菌與veA基因相關(guān)的差異蛋白，更好的認(rèn)識冠突散囊菌的產(chǎn)孢機(jī)理。

1.3.2?蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜法分析蛋白質(zhì)的原理是將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為離子，在一定的電場與磁場的共同作用下將具有不同質(zhì)荷比的蛋白質(zhì)分離開來。此方法靈敏度高、操作簡便、準(zhǔn)確性高、所需時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，但質(zhì)譜儀的造價(jià)十分昂貴，使用成本高。例如張麗君等人利用多維色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測出小鼠肝臟質(zhì)膜蛋白質(zhì)中的126種蛋白質(zhì)，其中包括41種膜蛋白。

2?蛋白組學(xué)在肝癌研究中的應(yīng)用

2.1?肝癌的起因

肝癌的發(fā)生是由于體內(nèi)多種基因的共同變化所引起的，而基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物為蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)是人體生命活動(dòng)的執(zhí)行者，所以研究蛋白質(zhì)的差異有利于對癌變的認(rèn)識。如周海軍等將正常人的肝細(xì)胞系與肝癌細(xì)胞的肝細(xì)胞系進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)有12個(gè)蛋白質(zhì)的糖基團(tuán)發(fā)生改變，論證了蛋白質(zhì)糖基團(tuán)的改變在肝癌的發(fā)生中起著作用。因此，用蛋白組學(xué)對肝癌進(jìn)行研究，可以使人們了解肝癌的起因，進(jìn)而預(yù)防肝癌的發(fā)生。

2.2?肝癌的診斷

盡早確診肝癌對于肝癌患者的治療與康復(fù)十分重要。對肝癌的診斷主要是尋找其標(biāo)志物。早期人們開始用甲胎蛋白作為其標(biāo)志物，目前仍是使用最佳的標(biāo)志物。但隨著研究蛋白組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對肝癌的其他標(biāo)志物的研究也在不但深入。例如高爾基體73蛋白、肝癌生長因子、異常凝血酶原……

2.2.1?甲胎蛋白

甲胎蛋白屬于糖蛋白，在人體內(nèi)的含量不高。甲胎蛋白與腫瘤的發(fā)生相關(guān)，它有許多功能：結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)、維持血漿滲透壓。甲胎蛋白對于細(xì)胞的增長和抑制都起著作用。當(dāng)甲胎蛋白超過一定的范圍后，肝癌發(fā)生的機(jī)率會(huì)很大。甲胎蛋白不僅可以檢測肝癌，同時(shí)也可以作為肝癌轉(zhuǎn)移與治療效果的指標(biāo)。

2.2.2?高爾基體73蛋白

高爾基73蛋白在正常的人體中也存在，但其含量很低或者幾乎沒有，但在肝癌患者的體內(nèi)含量較高。甲胎蛋白的敏感性較低，尤其是在肝癌轉(zhuǎn)移的方面。付超等人經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究得出，高爾基體73蛋白的敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于甲胎蛋白，具有很好的實(shí)用的臨床價(jià)值，在未來有可能成為人們診斷肝癌的新型標(biāo)志物。

2.2.3?肝癌生長因子

肝癌生長因子是肝癌和它周圍血管生長的必需物質(zhì)，屬于多肽類物質(zhì)。隨著惡性腫瘤的形成和生長，肝癌生長因子會(huì)擴(kuò)散到其周圍的血管里。高文斌等人發(fā)現(xiàn)手術(shù)前后惡性腫瘤的大小，甲胎蛋白和肝癌生長因子都有變化，并且肝癌生長因子的變化更為顯著，具有更高的敏感性。肝癌生長因子的較高的敏感性，使其可以診斷早期肝癌、判斷腫瘤大小。如果可以配合其他檢測肝癌的技術(shù)，會(huì)有更好的效果。

2.2.4?異常凝血酶原

近來越來越多的研究表明，異常凝血酶原具有相當(dāng)?shù)难芯績r(jià)值。殷正風(fēng)等人經(jīng)研究表明，當(dāng)腫瘤的直徑大于或等于2.1cm時(shí)，異常凝血酶原的含量會(huì)隨之增加。因此，異常凝血酶原可以作為肝癌的標(biāo)志物。

2.3?肝癌的轉(zhuǎn)移

肝癌患者死亡的主要原因是轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，肝癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是患者長期生存和手術(shù)效果的最大的困難。目前，有的學(xué)者為了更深入的了解肝癌的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)，用蛋白組學(xué)進(jìn)行研究。如孟春城等人研究檢測了血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子等蛋白質(zhì)，探究肝癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的影響因素，得出了肝癌的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、尿激酶型纖溶酶原酶活物等蛋白質(zhì)的表達(dá)無關(guān)。還有毛華等人研究了分裂原激活蛋白激酶p38信號傳導(dǎo)通路在抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)肝癌轉(zhuǎn)移，得出了血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子除了提供癌細(xì)胞增殖的營養(yǎng)外，還可以通過分裂原激活蛋白激酶p38信號引導(dǎo)癌細(xì)胞，導(dǎo)致肝癌的轉(zhuǎn)移。通過對比肝癌患者轉(zhuǎn)移前后體內(nèi)蛋白質(zhì)含量的差異，可以得出肝癌轉(zhuǎn)移的原因及影響因素。

2.4?肝癌的治療

肝癌目前的主要治療方法是外科手術(shù)切除，但因?yàn)楦伟┗颊咴谠缙诳赡苡修D(zhuǎn)移現(xiàn)象，再加上我國大多數(shù)肝癌患者在患肝癌的同時(shí)，伴有肝功能的下降，所以手術(shù)切除的作用并不完全。隨著蛋白組學(xué)的發(fā)展，其在肝癌的治療中也發(fā)揮著作用。例如Ding等運(yùn)用蛋白組學(xué)技術(shù)，得出了一些差異蛋白質(zhì)不僅可以作為肝癌診斷的標(biāo)志物，還可以減弱肝癌轉(zhuǎn)移的能力，為肝癌的靶向性治療提供了研究基礎(chǔ)，提高肝癌治療的成功率。

3?總結(jié)與展望

隨著社會(huì)的發(fā)展，人們對蛋白質(zhì)的研究技術(shù)也在不斷發(fā)展。質(zhì)譜法會(huì)進(jìn)一步突破，研究出使用成本較低的儀器;高效液相色譜可以定量分析蛋白質(zhì)的差異表達(dá)，可以分離過酸或分子量過小的蛋白質(zhì)。

蛋白組學(xué)也應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、尋找疾病分子標(biāo)記和藥物靶標(biāo)等許多的方面，對肝癌的探究也日益深入。通過對比肝癌患者與正常人體內(nèi)的差異蛋白，有助于研究肝癌的起因、轉(zhuǎn)移以及肝癌的治療方法，降低肝癌的發(fā)病率、提高治療的成功率。蛋白組學(xué)為肝癌的研究提供了一個(gè)全新且有力的平臺。研究不斷地創(chuàng)新，技術(shù)不斷發(fā)展。

現(xiàn)在，人們已經(jīng)在肝癌的起因、診斷、轉(zhuǎn)移、治療的方面有了一些研究，找到了部分標(biāo)記蛋白。在未來，可以利用蛋白組學(xué)找出具有更高敏感性的肝癌標(biāo)志物，更早的發(fā)現(xiàn)肝癌患者，使其盡早接受治療，增加康復(fù)率;找到引起肝癌的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的主要蛋白，研制出抑制此類蛋白質(zhì)的藥物，防止肝癌患者的病情加重;將蛋白組學(xué)應(yīng)用于臨床治療上，結(jié)合其他治療肝癌的技術(shù)，盡量彌補(bǔ)手術(shù)切除的缺陷，降低復(fù)發(fā)率。使肝癌不再是威脅人類生命的主要疾病。

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