芒柄花黃素對阿爾茨海默病小鼠血腦屏障通透性和海馬閉鎖小帶蛋白-1表達的影響

張英博 費洪新

(1齊齊哈爾醫學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2新余學院)

阿爾茨海默病(AD)是一種老年性、神經性、退行性和進行性的中樞神經系統常見疾病之一，其發病率隨著人口老齡化而增加，可采用多奈哌齊進行治療〔1〕。AD發生發展與血腦屏障(BBB)通透性增加有關〔2,3〕，維持BBB的基本結構包括血管內皮細胞、星形膠質細胞及周細胞，其中血管內皮細胞表面表達的閉鎖小帶蛋白(ZO)-1是血管內皮細胞緊密連接(TJ)的主要結構〔4,5〕。芒柄花黃素(FMN)具有調控BBB血管內皮細胞晚期糖基化終末產物受體(RAGE)表達、上調血管內皮生長因子(VEGF)和促進堿性成纖維細胞生長因子分泌等功能〔6,7〕。本研究探討FMN對AD小鼠BBB通透性和海馬ZO-1表達的影響機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物 健康2月齡清潔級雄性昆明小鼠56只，體質量(22±2)g，購于黑龍江中醫藥大學〔SCXK(黑)2013-012〕，常規飼養、給藥及給水。

1.2主要試劑 FMN(成都曼思特生物公司，16031005)；多奈哌齊(重慶植恩藥業有限公司，20141201)；β-actin(Santa Cruz Biotechnology公司，sc47778)；ZO-1(北京博奧公司，bs1329)；Aβ1～42、D-半乳糖(Sigma公司)；RNeasy@ Mini Kit(QIAGEN公司)，其他試劑由齊齊哈爾醫學院超微病理實驗中心提供。

1.3主要儀器 TGL-16G型臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；STW-1型腦立體定位儀(成都儀器廠)；7300型實時熒光定量儀(美國ABI 公司)；HMIAS型彩色分析系統(武漢千屏有限公司)；6100型RT-雷杜酶標儀(美國RT公司)；-80℃冰箱(日本SANYO公司)；超凈操作臺(北京東聯哈爾儀器制造有限公司)等。

1.4動物模型制備、實驗分組及治療方法 昆明小鼠56只按照隨機數字表分出8只為對照組，余下48只制備AD小鼠模型。參考文獻〔8，9〕方法，小鼠麻醉后去除頭毛發后固定，定位海馬，雙側腦室連續注入10 μg Aβ1～42(終濃度為2 mg/ml)，留針10 min，包扎，腹腔注射D-半乳糖(終濃度為180 mg/kg)。8只造模失敗，將造模成功40只AD模型小鼠按照隨機數字表分模型組、多奈哌齊組、FMN高、中、低劑量組。多奈哌齊組給予多奈哌齊(1 mg/kg)灌胃；FMN高、中、低劑量組分別給予FMN 30.0、15.0、7.5 mg/kg灌胃；對照組、模型組給予生理鹽水灌胃，連續灌胃35 d。

1.5測定BBB通透性 參考文獻〔10〕方法，用腦伊文思藍(EB)含量表示BBB通透性。小鼠灌胃結束后尾靜脈注射EB(2%)，麻醉后左心室灌注生理鹽水70 ml沖洗，冰臺上取腦并記錄腦濕重，52℃恒溫烘烤72 h后記錄腦干重。將腦放于甲酰胺溶液中浸泡，45℃避光孵育72 h后勻漿，3 000 r/min離心10 min。在酶標儀上630 nm處測定上清液吸光度值(A)并計算EB含量。腦含水量=〔(腦濕重-腦干重)/腦濕重〕×100%。EB含量=EB濃度/腦濕重(μg/g)。

1.6檢測海馬ZO-1表達 昆明小鼠灌胃給藥結束后，對小鼠進行心臟灌注甲醛，按照免疫組化試劑盒說明書進行操作，包括制備腦石蠟切片、脫蠟、過氧化物酶處理、封閉、滴加抗體、顯色、復染、透明、封片等基本步驟，采用HMIAS型彩色分析系統計算分析海馬積分光密度值。

1.7檢測海馬ZO-1基因表達 昆明小鼠灌胃給藥結束后處死小鼠，取材小鼠海馬，按照Trizol試劑盒方法提取海馬總RNA，合成cDNA后聚合酶鏈反應(PCR)擴增。設計β-actin、ZO-1 mRNA引物：β-actin上游 5′-CGT GCG TGA CAT CAA AGA GAA-3′，下游 5′-AAC CGC TCG TTG CCA ATA GT-3′；ZO-1上游5′-GTA ACC ATT TTT GGA CCA ATA GCT G-3′，下游5′-GCC AGA GCT ACG TTG GTC AGT T-3′，引物由上海生物工程公司合成。將反應體系配置成50 μl，50℃反應15 min，95℃反應15 min，94℃反應15 s，55℃反應45 s，40個循環，iQTM5軟件分析PCR樣本Ct值，按照公式(2-△△Ct法)計算ZO-1相對表達量。

1.8檢測海馬ZO-1表達 昆明小鼠灌胃給藥結束后，對小鼠進行心臟灌注生理鹽水后處死小鼠，取材小鼠海馬，將海馬裂解并測定蛋白濃度。蛋白經過100℃變性5 min、分離、轉膜、封閉、加一抗、加二抗、顯色、曝光等基本步驟，采用HMIAS型彩色分析系統，以目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值計算ZO-1相對表達強度。

1.9統計分析 采用SPSS19.0軟件單因素方差分析和t檢驗。

2 結 果

2.1BBB通透性 相較于對照組，模型組腦含水量、腦EB含量明顯增加(P<0.05)；相較于模型組，FMN高、中劑量組和多奈哌齊組腦含水量、腦EB含量明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組BBB通透性比較

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.2海馬ZO-1表達 與對照組比較，模型組海馬ZO-1積分光密度值、mRNA相對表達量、蛋白相對表達強度明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，FMN高、中劑量組和多奈哌齊組海馬ZO-1積分光密度值、mRNA相對表達量、蛋白相對表達強度明顯升高(P<0.05)，而FMN低劑量組海馬ZO-1積分光密度值、mRNA相對表達量、蛋白相對表達強度改變不明顯(P>0.05)。見表2。

表2 各組海馬ZO-1表達

3 討 論

AD發病機制極其復雜，可伴有BBB血管內皮細胞結構異常而出現通透性增加和腦水腫，本實驗結果提示FMN高、中劑量可改善BBB血管內皮細胞結構，降低BBB通透性，減少部分水分進入腦內，減輕腦水腫，小鼠海馬血管內皮細胞BBB通透性升高時伴有海馬緊密連接關鍵蛋白ZO-1表達降低，而小鼠海馬血管內皮細胞BBB通透性降低時伴有海馬緊密連接關鍵蛋白ZO-1表達升高，本文結果表明，FMN高、中劑量可改善AD小鼠BBB通透性，這與降低ZO-1表達有一定關系。

綜上，FMN通過抑制海馬ZO-1表達來改善AD小鼠BBB通透性，這為FMN通過ZO-1信號通路來防治AD奠定了基礎。