12/15-脂氧合酶通過15-HETE/PPARγ途徑減輕大鼠腦缺血再灌注損傷

王永健 王海軍 于洋 李瑞卿 張嘉偉

(齊齊哈爾醫學院附屬第一醫院神經內科，黑龍江 齊齊哈爾 161041)

腦缺血再灌注損傷能夠引起腦部更加嚴重的功能障礙，并且隨著不斷實施的溶栓治療，腦缺血再灌注損傷的危害愈發明顯。腦缺血再灌注后能夠引起一系列病理損傷，包括中心區腦神經元壞死、神經元凋亡及去極化、氧自由基的產生等〔1〕。氧自由基的產生是導致氧化應激損傷的重要原因，而體內一些酶的代謝產物能夠介導炎癥及氧化應激損傷〔2〕。

12/15-脂氧合酶可氧化花生四烯酸和亞油酸分別生成12-羥基二十碳四烯酸(HETE)、15-HETE、13-羥基十八碳二烯醇(HODE)等產物〔3〕，而這些產物能夠激活過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ〔4〕。研究發現，缺血再灌注損傷可顯著誘導腦組織PPARγ表達和核移位增加〔5〕。同時，PPARγ激活可減小腦梗死體積，降低炎性介質細胞間黏附分子-1、白介素-1β、環氧合酶-2 等的表達〔6〕，說明腦缺血引起的PPARγ表達和活性增加可能是機體對于損傷的一種保護性反應。然而，激活PPARγ的內源性物質并不明確。有研究證明，15-HETE 在人血管平滑肌細胞、成纖維細胞中也可激活PPARγ，同時增加PPARγ mRNA水平〔7〕。 然而在腦內是否由于12/15-脂氧合酶的代謝產物如15-HETE激活了PPARγ，進而降低腦缺血再灌注損傷并不明確。本文擬對可能的機制進行探討。

1 材料與方法

1.1試劑及器材 15-HETE 購于美國 Biomol 公司；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度定量試劑盒購自碧云天生物試劑有限公司；PPARγ抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；12/15-脂氧合酶抗體購自美國Cayman Chemical公司；二抗為相應辣根過氧化物耦聯的抗體，購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；其他試劑均為市售分析純。線栓購自北京西濃科技有限公司，Molecular Imager ChemiDoc XRS+System 曝光儀為美國Bio-Rad公司產品。

1.2模型制備 SPF級SD雄性大鼠90只，體重200～220 g，購自齊齊哈爾醫學院。線栓法制備大鼠大腦中動脈梗阻缺血60 min再灌注24 h模型(MCAO/R)。主要步驟：大鼠術前12 h 禁食，但不禁水，4%水合氯醛麻醉后固定于手術臺上，取頸部正中切口2 cm，銳性分離頸前正中肌群，分離辨認左側頸內動脈、頸外動脈后結扎離斷頸外動脈，將0.22 mm硅膠線栓緩慢插入約10 mm，同時開始記錄缺血時間。 阻斷60 min后緩慢拔出線栓恢復血流再灌注，縫合手術切口。大鼠蘇醒后自由飲水和進食。以缺血對側肢體癱瘓為模型成功的標志。大鼠隨機分為3組(n=30)。假手術組僅手術暴露、分離頸總、頸內及頸外動脈，不插入線栓；模型組制備MCAO/R模型，在缺血前30 min右側腦室注入與干預組相同體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)；干預組制備MCAO/R模型，缺血前30 min右側腦室注入15 μl的15-HETE。 所有動物于模型制備成功24 h后處死。

1.3總蛋白提取 取缺血側腦皮質進行蛋白提取和分離。處死后的大鼠取全腦，分離腦皮質，置于-80℃冰箱保存。 將不同組的腦皮質50 mg置于500 μl的放射免疫沉淀實驗(RIPA)細胞裂解液中，低溫勻漿，12 000 r/min離心，取上清液，用BCA蛋白濃度定量試劑盒進行定量分析。蛋白變性后，于-20℃冰箱中保存。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離目的蛋白，將蛋白轉印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉常溫封閉2 h，4℃孵育一抗(1∶1 000)、過夜，吐溫20-Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗3次，每次10 min，常溫孵育二抗1 h，TBST洗3次，每次10 min，顯色試劑盒進行顯色，Imagelab軟件進行灰度分析。

1.4Real Time-PCR 取缺血側腦皮質進行 mRNA提取和分離。定量稱取100 mg腦皮質置于1 ml TRIzol中勻漿提取總RNA。通過測定260、280 nm吸光度測定RNA濃度。取500 ng總RNA 通過PrimeScript RT reagent 試劑盒進行逆轉錄反應。通過SYBR Premix EX Taq試劑盒進行熒光定量反應。12/15-脂 氧合酶上 游 引 物 序 列 5′-TGGGTTCAGGGCAGAAGCAT-3′，下游引物序列5′-GCGGGCAGGAAGACAAGTAGAG-3′ 。PPARγ上游引物序列5′-GTGCCAGTTTCGATCCGTAGA-3′，下游引物序列5′-GGCCGACATCGTGTAGTAGA-3′。內參 GAPDH 上游引物序列 5′-AGAACATCATCCCTGCATC-3′，下 游 引 物 序列 5′-TGGATACATTGGGGGTAGG-3′。實驗數據分析采用 2-ΔΔCt方法。

1.515-HETE含量檢測 使用Assay Design公司的15-HETE酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒對腦組織中15-HETE的含量進行測定，按試劑盒說明書進行操作。

1.6統計學處理 采用SPSS13.0 軟件行單因素方差分析。

2 結 果

2.1腦缺血再灌注損傷后12/15-脂氧合酶表達水平變化 模型組12/15-脂氧合酶基因表達水平(1.27±0.07)明顯高于假手術組(1.01±0.13)，24 h基因水平升高了27%。與基因水平結果類似，與空白組蛋白水平(1.01±0.04)相比，模型組12/15-脂氧合酶蛋白表達(1.32±0.21)明顯升高，24 h蛋白水平提高了30%。見圖1。

2.2腦缺血再灌注損傷后15-HETE含量變化 與假手術組(2.69±0.32)相比，模型組15-HETE在腦內的水平(3.85±0.28)提高了43%，說明蛋白表達的變化引起了酶功能的改變。

圖1 假手術組和模型組腦內12/15-脂氧合酶表達

2.3腦內PPARγ含量的變化 與假手術組(1.05±0.03)相比，模型組腦內PPARγ基因表達(1.26±0.09)明顯增加，增加了20%。與基因水平結果類似，與空白組PPARγ蛋白水平(1.17±0.13)相比，模型組PPARγ蛋白水平(1.58±0.16)增加了35%，說明腦缺血再灌注損傷能夠造成PPARγ在基因和蛋白水平的激活。見圖2。

2.4腦內注射15-HETE后PPARγ表達變化 腦內注射15-HETE后，與模型組PPARγ基因水平(1.08±0.05)和蛋白水平(1.63±0.15)相比，干預組PPARγ在基因和蛋白水平表達明顯升高，PPARγ在基因水平(1.24±0.11)提高了15%，在蛋白水平(2.20±0.27)提高了30%。見圖3。

圖2 假手術組和模型組腦內PPARγ表達

圖3 干預組和模型組腦內PPARγ表達

3 討 論

缺血性腦病致死和致殘率均較高，是腦血管病中主要的一種類型，缺血區血流的再灌注可引起腦組織損傷及相關功能障礙即腦缺血再灌注損傷〔8〕。缺血再灌注損傷能夠引起腦內氧化應激的改變進而引起神經元凋亡〔9〕。腦內氧化應激基因水平的改變是機體的一種保護機制，也為臨床治療提供了新的靶點。花生四烯酸和亞油酸代謝通路是典型的氧化應激反應通路〔10〕。12/15-脂氧合酶能夠催化花生四烯酸和亞油酸產生15-HETE等生物活性物質，參與腦損傷的病理過程。同時，PPARγ與氧化應激反應密切相關，而且，PPARγ激活能降低腦損傷程度，如減少腦損傷面積。PPARγ激活劑羅格列酮可減輕繼發性腦損傷，并且對神經元有保護作用〔11〕。

本研究結果說明12/15-脂氧合酶參與了缺血再灌注損傷的過程。吳國建等〔2〕也發現，創傷性腦損傷后12/15-脂氧合酶的表達明顯升高。本研究結果表明，造模后腦內15-HETE的含量明顯增加，說明12/15-脂氧合酶在蛋白水平的變化引起了其功能改變；而PPARγ能被進一步激活，說明調節內源性生物活性物質能夠激活PPARγ，也為腦缺血再灌注損傷的治療提供了新的思路。