蟲草菌絲對2型糖尿病大鼠認知功能障礙的影響

劉行海 劉紅 鄭倩 劉華 買文麗

(川北醫學院生理學教研室， 四川 南充 637000)

2型糖尿病(T2DM)可累及中樞神經系統，導致認知功能障礙，重者可發展為癡呆〔1，2〕。糖尿病認知功能障礙嚴重影響患者生活質量。近年來中草藥對糖尿病的防治作用受到廣泛關注。人工蟲草菌絲(CS)是人工發酵培養得到的菌絲。現代藥理學證明其對中樞神經系統、心血管系統、呼吸系統及免疫系統有一定作用。本課題組前期工作發現，CS具有能保護胰島細胞的作用〔3〕。本研究探討CS對T2DM大鼠認知障礙的影響及其機制。

1 資料與方法

1.1材料 CS(上海雅吉公司，蒸餾水配制：20 mg/ml)；鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)；血糖儀(長沙三諾科技公司)；血清胰島素檢測試劑盒(上海市生物制藥研究所)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(南京建成生物公司)；大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國GBD公司)；Morris水迷宮計算機圖像實時分析系統(成都泰盟有限公司)。

1.2T2DM大鼠模型建立 參照本實驗室既往方法〔4〕，12周齡健康雄性清潔級Wistar大鼠50只，體質量(195±16)g。動物合格證號：SYXK(川)2013-076。動物及飼料均由川北醫學院實驗動物中心提供。自由進食飲水適應性飼養1 w后，隨機分出對照組8只，全程采用常規飼料飼養。其余42只采用高能飼料喂養4 w，空腹12 h后一次性腹腔注射STZ 25 mg/kg(STZ臨時用0.1 mol/L，pH=4.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配成1%濃度)。繼續高能飼料飼養4 w后，采尾靜脈血測定空腹血糖(FBG)、空腹血清胰島素(FINS)，計算胰島素敏感指數(ISI)，以FBG>7.8 mmol/L，同時伴有ISI降低作為T2DM模型判斷標準〔5〕。34只大鼠復制成功T2DM模型，其余淘汰。

1.3實驗動物分組與處理 將成功造模的34只大鼠隨機分成模型組10只，CS低劑量(CS1)組8只〔1.5 ml/(kg·d)〕、CS中劑量(CS2)組8只〔3 ml/(kg·d)〕、CS高劑量(CS3)組8只〔6 ml/(kg·d)〕。CS各劑量組每日灌胃給予CS，連續給藥4 w。模型組和對照組每日給予等量的生理鹽水灌胃。給藥期間，全部大鼠常規飼料飼養。

1.4Morris水迷宮測試學習記憶能力 各組給藥4 w末進行水迷宮測試7 d(繼續給藥)。定向航行實驗：第 1～5 天，記錄2 min內各組逃避潛伏期(從入水到爬上對角線象限的平臺所需時間)。空間探索實驗：第6天開始，撤去平臺，任選一入水點，記錄2 min內大鼠在目標象限停留時間。

1.5標本采集及指標測定 Morris水迷宮測試完畢后，大鼠空腹12 h，然后從心臟穿刺采血制備血漿和血清標本并于-80℃保存待測，斷髓處死,取腦組織凍存待檢。按照試劑盒說明書檢測FBG、FINS水平及海馬組織SOD活性、MDA、TNF-α含量。

1.6統計學分析 應用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1一般情況 對照組大鼠身體狀況良好。模型組具有糖尿病典型癥狀，反應遲鈍，活動減少，毛發紊亂無光澤。隨著病程延長,除大鼠體重呈下降趨勢外,其他癥狀和體征更加明顯。各CS干預組上述情況均有不同程度改善。模型組死亡3只，CS1組死亡2只， CS2組死亡1只。

2.2各組FBG、FINS和ISI比較 與對照組相比，模型組FBG與FINS水平明顯升高，ISI明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，CS2組和CS3組FBG與FINS水平降低， ISI明顯升高 (P<0.05)。CS的作用呈劑量依賴性，見表1。

2.3各組Morris水迷宮實驗比較 與對照組比較，模型組逃避潛伏期明顯延長，在原平臺象限停留的時間明顯縮短 (P<0.05)。與模型組比較，CS3組逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)；CS2、CS3組在原平臺象限停留的時間明顯增加(P<0.05 )，見表2。

2.4各組SOD活性、MDA和TNF-α含量比較 與對照組比較，模型組SOD活性明顯降低，MDA、TNF-α含量明顯增高(P<0.05)。與模型組比較，CS2組、CS3組SOD活性明顯升高，MDA、TNF-α含量明顯降低(P<0.05)，見表3。

表1 各組FBG、FINS和ISI比較

與模型組比較：1)P<0.05，下表同

表2 各組Morris水迷宮實驗比較

表3 各組SOD活性和MDA、TNF-α含量比較

3 討 論

目前對T2DM認知功能障礙發病的確切機制尚不明了。已有研究提示，基因調控異常、炎癥狀態、氧化應激、內質網系統異常、糖基化終末產物積累等多個因素參與了T2DM患者認知功能障礙發生、發展全過程〔6〕。近年來，炎癥在T2DM認知功能障礙發病中的作用越來越受到重視。炎癥可能作為多種機制的下游關鍵環節起損害作用〔7〕。Sandireddy等〔8〕報道T2DM患者體內的高血糖可激活多種代謝途徑，如多元醇途徑、蛋白激酶C途徑、晚期糖基化終產物途徑和己糖胺途徑等，所有這些途徑可以直接或間接啟動和促進炎癥的神經損傷。

海馬是學習和記憶的關鍵區域〔9〕。TNF-α為促炎癥細胞因子〔10〕。Jia等〔11〕研究證實，STZ誘導病程5 w的糖尿病大鼠記憶能力明顯受損，并伴有海馬組織中TNF-α含量升高，這可能證實TNF-α含量與糖尿病大鼠的認知功能障礙密切相關。本實驗結果提示，CS對糖尿病大鼠認知功能障礙的改善可能與降低海馬TNF-α 含量，抑制炎癥反應有關。

氧化應激在糖尿病認知障礙的發生發展過程中發揮重要作用。SOD是體內主要抗氧化酶，保護組織細胞免受氧自由基的損傷；MDA水平反映脂質過氧化程度，其水平升高可提示組織細胞損傷〔12〕。本實驗結果表明，T2DM大鼠海馬組織中MDA含量增加， SOD活性降低；而CS干預后，明顯增強了抗氧化酶活性，減輕了海馬組織的損傷。

總之，CS能提高T2DM大鼠學習記憶能力，改善認知功能障礙，其機制可能主要與CS降低T2DM大鼠體內血糖，減輕腦部炎癥反應和提高抗氧化能力有關。