熱休克蛋白70與心肌缺血再灌注損傷大鼠心房顫動及心肌纖維化的關聯

代菁 詹莉 張波 劉超

(1江漢大學附屬醫院暨武漢市第六醫院，湖北 武漢 430015；2武漢市第八醫院；3天津市胸科醫院心血管病研究所)

缺血性心臟病是導致心房顫動(房顫)的主要誘因，心肌缺血再灌注損傷是心肌梗死患者再灌注治療后的后遺癥，直接導致患者心功能下降〔1～3〕。心肌缺血再灌注損傷的誘因有多種，如心肌抑頓、微血管痙攣、內皮細胞水腫、血栓脫落栓塞及炎癥因子作用和原位血栓形成等〔4〕。心肌缺血再灌注損傷同樣會導致心肌纖維化，其中心肌細胞外基質(ECM)的主要成分是心肌纖維細胞分泌的膠原纖維，對維持心臟的正常生理功能有重要作用〔5〕。在健康心臟中，腫瘤壞死因子(TNF)-α控制著心肌ECM降解與合成〔6〕。當在缺血缺氧狀態下，機體中的EMC合成與降解會失衡，進而使心肌間質重構及心肌纖維化。當心肌發生纖維化后會對心臟功能產生嚴重的不良影響〔7〕。TNF-α主要在一些炎癥性疾病如類風濕關節炎和病毒性心肌炎等中起重要作用〔8〕。同時，也是導致心肌功能損傷的主要原因，會導致心肌缺血再灌注后心肌灌流下降的主要因素，還會上調相關白細胞介素因子的表達，從而加重心肌缺血再灌注后心肌纖維化。熱休克蛋白(HSPs)細胞是在生理或病理狀態刺激下誘導合成的一種細胞內源性保護蛋白〔9〕。在應激狀態下，其表達水平顯著升高〔10〕。研究顯示，在缺血再灌注損傷中HSP70會異常表達，并隨著再灌注時間的延長而升高〔11〕。目前對HSP70與心肌缺血再灌注損傷大鼠房顫及心肌纖維化的關聯還不清楚。本研究測定大鼠心肌組織中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)活性及心肌和血清TNF-α表達和心肌組織HSP70蛋白表達，探討HSP70與心肌缺血再灌注損傷大鼠房顫及心肌纖維化的關聯。

1 材料與方法

1.1實驗材料與試劑 選取雄性健康SD大鼠48只，體重180～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。生長溫度為(23±2)℃，環境濕度為45%～50%，光照時間為每天12 h，自由進食、進水，適應性飼養1 w。隨機分為正常對照組、缺血30 min組、再灌注60 min組和再灌注120 min組，每組12只。SOD和MDA活性測定試劑盒購自南京建成生物科技有限公司；HSP70抗體和TNF-α抗體購自Santa Cruz公司；TNF-α酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自欣博盛公司。

1.2動物模型的建立 使用20%烏拉坦(7 ml/kg)對大鼠進行腹腔注射麻醉，采用針形電極插入四肢以觀測心電圖。將大鼠氣管切開，打開胸腔暴露心臟，穿過心肌淺層進行結扎。正常對照組：穿線但不結扎；缺血30 min組：穿線并結扎，以結扎線以下心肌顏色變暗為標志，證實已經造成心肌缺血；再灌注60 min組：處理步驟同缺血30 min組，待缺血30 min后松開結扎線，恢復再灌注60 min；再灌注120 min組：處理步驟同缺血30 min組，待缺血30 min后松開結扎線，恢復再灌注120 min。待以上各組處理結束后，采用摘除眼球法取血備檢，同時摘取心臟備檢。

1.3心電圖監測 在動物模型建立的前一天開始進行24 h動態心電圖監測，監測至實驗結束。

1.4心肌組織中SOD和MDA的測定 在實驗結束后，摘取大鼠心臟，用4℃生理鹽水進行沖洗備用。準確稱取0.2 g心肌組織，加入適量生理鹽水，研磨成組織勻漿液，3 000 r/min離心15 min，取上清液進行心肌組織SOD活性和MDA含量測定。按試劑盒說明書，采用化學擴增法測定SOD活性，用硫代正比妥酸(TBA)法測定MDA含量。

1.5血清中TNF-α表達檢測 實驗結束后，收集大鼠血液樣本1 ml，3 000 r/min離心20 min。取上清液保存于-80℃備檢。使用ELISA檢測試劑盒測定血清TNF-α濃度。

1.6心肌組織中TNF-α和HSP70表達檢測 采用Western印跡法檢測心肌組織TNF-α表達。將選取的心肌組織樣本剪切為細小碎片，稱取20 mg心肌組織，加入200 μl組織裂解液。采用組織勻漿機對心肌組織進行勻漿，直至充分裂解。使用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度測定試劑盒對蛋白濃度進行測定。樣本上樣量為20 μg，使用10%的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行電泳分離，電泳結束后，將蛋白轉移至硝酸纖維素(NC)膜上。采用5%的脫脂奶粉溶液對NC膜進行封閉后，加入1∶1 000的TNF-α和HSP70抗體4℃孵育過夜。一抗孵育結束后，使用1∶100二抗室溫孵育2 h。采用化學發光法對NC膜進行顯色。分析目的蛋白和內參β-actin的Western印跡條帶。

1.7統計學處理 采用SPSS20.0統計分析軟件進行單因素方差分析或者重復測量的方差分析及LSD-t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1各組房顫持續時間 正常對照組未見房顫。缺血30 min組和再灌注各組房顫時間均逐漸升高(P<0.05)。見表1。

2.2各組心肌組織中SOD活性 與正常對照組相比，心肌組織中SOD活性于缺血30 min開始降低至再灌注120 min達到最低值(P<0.05)。見表1。

2.3各組心肌組織中MDA含量 與正常對照組相比，心肌組織中MDA含量于缺血30 min開始升高至再灌注120 min達到最大值(P<0.01)。見表1。

2.4各組血清中TNF-α含量的測定 與正常對照組相比，缺血30 min組血清中TNF-α表達量顯著增加(P<0.05)；與缺血30 min組相比，再灌注各組血清中TNF-α表達量顯著增加，至再灌注120 min達到高峰(P<0.05)，見表1。炎癥因子TNF-α異常升高是心肌缺血再灌注心肌纖維化可能因素之一。

表1 各組房顫持續時間、心肌組織SOD、MDA水平和血清TNF-α含量

與正常對照組相比:1)P<0.05；與缺血30 min組相比:2)P<0.05，3)P<0.01

2.5各組心肌組織中HSP70含量 與正常對照組相比，缺血30 min組心肌組織中HSP70蛋白表達顯著增加，再灌注各組與缺血30 min組相比HSP70蛋白表達也明顯增加，說明HSP70蛋白表達會隨著心肌缺血再灌注損傷的加重而增加。見圖1。

圖1 各組心肌組織中HSP70表達

2.6各組心肌組織中TNF-α表達 心肌組織TNF-α在缺血再灌注各組中的表達均顯著高于正常對照組，這與血清中TNF-α的表達規律相同。見圖2。

圖2 各組心肌組織中TNF-α表達

3 討 論

再灌注損傷是缺血恢復血流灌注后心肌細胞轉化為不可逆性損傷〔12〕。機體在心肌缺血后再灌注后會釋放出大量內源性有害因子，如興奮氨基酸和氧自由基等，同時也會釋放出內源性保護因子如HSP70等。近年來關于心肌保護方面的研究，更多關注于HSP70的內源性保護途徑〔13〕。HSP70是組織細胞受到氧化損傷后產生的一種應激蛋白。在臨床心臟外科術后和心肌缺血再灌注動物模型都能檢測到HSP70陽性表達，并被證實是由心肌缺血再灌注損傷導致的〔14〕。本研究結果提示，HSP70蛋白表達會隨著心肌缺血再灌注損傷加重而增加，具有再灌注時間依賴性，證實HSP70蛋白與心肌缺血再灌注損傷發生與發展相關。同時，本研究結果證實了HSP70隨著再灌注時間延長表達增強。在心肌缺血再灌注損傷的過程中，往往會導致房顫〔15〕。心肌缺血再灌注損傷中，氧自由基是導致缺血再灌注損傷的直接原因。氧自由基產生會損傷心肌細胞膜、破壞心肌細胞的結構及產生大量的脂質過氧化物〔16〕。MDA是氧自由基脂質過氧化的終產物，SOD是體內清除氧自由基的主要酶系。因此，MDA可以反映氧自由基含量和脂質過氧化程度的指標〔17〕。SOD可以作為反映機體抗脂質過氧化的能力。本研究說明心肌缺血再灌注后機體產生了大量的氧自由基，使機體中SOD的消耗量增加，機體內氧自由基酶性清除系統受到破壞，從而導致心肌損傷。心肌缺血再灌注大鼠心肌纖維化與TNF-α的異常高表達密切相關。在缺血再灌注后，心肌纖維化也是導致心功能降低的因素之一〔18〕。心肌纖維化是心肌ECM中膠原纖維過量聚積導致的，存在于多種心血管疾病中〔19〕。在心肌缺血再灌注時，心肌細胞會分泌過量的膠原纖維，增加心肌僵硬度，使心肌血流供應減慢，進一步加重心肌缺血。已有研究證實，動物注射TNF-α后，會導致心臟功能障礙、心力衰竭及心肌纖維化〔20〕。本研究結果說明炎癥因子TNF-α的異常升高是心肌缺血再灌注心肌纖維化的可能因素之一。綜上，心肌細胞內HSP70表達水平與心肌缺血再灌注大鼠房顫及心肌纖維化相關。同時，心肌缺血再灌注損傷會導致大鼠房顫，并通過加重炎癥反應導致房顫和心肌纖維化。HSP70可作為心肌缺血再灌注損傷發展和惡化的重要標志。