黃芩苷鎂鹽對(duì)CCl4誘導(dǎo)的SD大鼠急性肝損傷的影響

郭亞春 李衛(wèi) 黃群 白冰 宋鴻儒 劉翠哲

(1承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000；2承德監(jiān)獄醫(yī)院；3河北北方學(xué)院)

四氯化碳(CCl4)是一種對(duì)肝細(xì)胞有嚴(yán)重毒性作用的化學(xué)物質(zhì)。誘導(dǎo)肝損傷的主要機(jī)制與激活機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)〔1〕。CCl4肝損傷模型所表現(xiàn)的肝細(xì)胞損傷、壞死、纖維化等，與一些臨床常見(jiàn)的酒精肝損傷、病毒肝損傷等類似〔2〕。因此，CCl4誘導(dǎo)肝損傷模型是目前常用的肝損傷模型之一。黃芩苷是從中藥黃芩中提取出的一種具有清除自由基、抗氧化、抗炎等多種藥理作用的黃酮類化合物。黃芩苷可以通過(guò)抗氧化活性對(duì)CCl4誘導(dǎo)肝損傷產(chǎn)生保護(hù)作用〔3〕，但其水溶性極差，限制了其臨床應(yīng)用。黃芩苷鎂鹽為黃芩苷在中藥黃芩中的原本存在形式，其水溶性極好〔4〕。本研究通過(guò)建立CCl4誘導(dǎo)SD大鼠急性肝損傷模型，尾靜脈注射不同濃度的黃芩苷鎂鹽，探討黃芩苷鎂鹽對(duì)CCl4誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用及有效的藥物治療濃度。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠80只，實(shí)驗(yàn)起始體重150～170 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；所有動(dòng)物于清潔級(jí)動(dòng)物室飼養(yǎng)，自由飲食，定時(shí)換氣，室內(nèi)溫度(22±2)℃，室內(nèi)濕度為70%，每日光照10 h。

1.2藥物 黃芩苷鎂鹽(承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所劉翠哲教授課題組提供，純度93.1%)；CCl4(購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；異甘草酸鎂注射液(購(gòu)于正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(美國(guó)thermo公司)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測(cè)定試劑盒、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。721N可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；Leica RM2235石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica儀器公司)；酶標(biāo)儀(加拿大Biotek公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1動(dòng)物分組與造模 實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組〔異甘草酸鎂，18 mg/(kg·d)〕及黃芩苷鎂鹽Ⅰ〔12.5 mg(kg·d)〕、Ⅱ〔25.0 mg/(kg·d)〕、Ⅲ〔50.0 mg/(kg·d)〕、Ⅳ〔100.0 mg/(kg·d)〕、Ⅴ〔200.0 mg/(kg·d)〕組，每組10只，尾靜脈連續(xù)給藥1 w。正常對(duì)照組與模型組每天尾靜脈注射等體積的無(wú)菌生理鹽水。末次給藥2 h后，除正常對(duì)照組腹腔注射等體積的橄欖油外，其余各組按1 ml/kg腹腔注射50%的CCl4溶液進(jìn)行模型制備。

1.4.2血生化指標(biāo)檢測(cè) 各組大鼠腹主動(dòng)脈取血，置于冰上，靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，取血清樣本，送承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中ALT、AST活性。

1.4.3肝臟病理組織切片觀察 各組大鼠均取肝左大葉的相同部位組織以10%中性甲醛固定24 h，切取約3 mm厚的組織置于全自動(dòng)脫水機(jī)中常規(guī)脫水，包埋，行4 μm厚度連續(xù)切片，然后常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，封片，光鏡下檢查各組大鼠肝組織損傷情況。

1.4.4肝組織勻漿檢測(cè) 按南京建成生物工程研究所肝組織勻漿制備說(shuō)明書(shū)制備10%肝組織勻漿，BCA法測(cè)定肝組織勻漿蛋白濃度。按MDA測(cè)定試劑盒說(shuō)明，配制標(biāo)準(zhǔn)管、空白管、測(cè)定管、對(duì)照管，應(yīng)用硫代巴比妥酸法測(cè)定各組大鼠肝組織受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各組大鼠的體重均有所增加，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠體重較輕，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，毛色黯淡，毛質(zhì)粗糙。黃芩苷鎂鹽各組與異甘草酸鎂組大鼠的上述情況均有所改善。

2.2各組大鼠血ALT、AST活性的變化情況 與正常對(duì)照組相比，模型組ALT、AST水平顯著增高(P<0.01)。與模型組相比，黃芩苷鎂鹽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組ALT、AST水平均顯著降低(P<0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組黃芩苷鎂鹽ALT水平均顯著降低(P<0.05)，黃芩苷鎂鹽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組AST水平與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3肝組織病理學(xué)改變 正常對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列規(guī)則，胞質(zhì)染色均勻，鏡下可清晰看到完整的細(xì)胞核。模型組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞明顯，細(xì)胞間隙變大，胞質(zhì)染色不均，胞質(zhì)間可見(jiàn)明顯脂滴，出現(xiàn)明顯的氣球樣變，細(xì)胞核出現(xiàn)偏移、固縮。黃芩苷鎂鹽Ⅰ、Ⅱ組肝細(xì)胞間隙的破壞和氣球樣變較模型組有所改善，黃芩苷鎂鹽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞有明顯改善。陽(yáng)性對(duì)照組較模型組的病理?yè)p傷也具有明顯改善。見(jiàn)圖1。

2.4肝組織勻漿中MDA含量的變化 與正常對(duì)照組相比，模型組肝組織MDA水平顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組與黃芩苷鎂鹽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組均顯著降低肝組織中MDA水平(P<0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，黃芩苷鎂鹽Ⅳ、Ⅴ組MDA降低水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組ALT、AST 及MDA水平變化情況

與正常組比較:1)P<0.01;與模型組比較:2)P<0.05;3)P<0.01;與陽(yáng)性組比較:4)P<0.05;5)P<0.01

正常對(duì)照組

模型組

陽(yáng)性對(duì)照組

黃芩苷鎂鹽Ⅳ組

3 討 論

急性肝損傷是由多種因素共同參與所導(dǎo)致的一種復(fù)雜的病理過(guò)程。長(zhǎng)期肝損傷最終可導(dǎo)致肝硬化、肝癌等疾病的發(fā)生。因此，深入研究和探討急性肝損傷的發(fā)病機(jī)制及有效治療措施，對(duì)肝臟疾病的防治具有重要意義。CCl4急性肝損傷模型是用于保肝藥物篩選的經(jīng)典模型之一〔5〕。CCl4在體內(nèi)經(jīng)肝細(xì)胞微粒體中的細(xì)胞色素P450 酶系代謝，其代謝產(chǎn)物Cl·和CCl3·可大量消耗機(jī)體超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽等抗氧化物，致使機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激〔6〕，從而引起肝微粒體及肝細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化等一系列的連鎖反應(yīng)，致使肝細(xì)胞膜被破壞，導(dǎo)致肝細(xì)胞的變性及壞死〔6,7〕。

ALT和AST主要存在于肝細(xì)胞胞質(zhì)中，當(dāng)肝細(xì)胞膜破裂時(shí)，血清中的ALT及AST水平將明顯升高，因此，ALT和AST是反映肝細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)。MDA是組織細(xì)胞生物膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)后的產(chǎn)物，肝組織中的MDA 水平不僅可以反映肝臟細(xì)胞生物膜的脂質(zhì)過(guò)氧化水平，還可以反映肝臟疾病嚴(yán)重程度〔8〕。因此本研究將大鼠血清中ALT、AST及肝組織中MDA水平作為反映肝損傷的指標(biāo)。研究顯示CCl4造模后大鼠血清中ALT、AST及肝組織中MDA水平較正常對(duì)照組顯著升高，提示急性肝損傷大鼠模型制備成功。應(yīng)用不同濃度的黃芩苷鎂鹽尾靜脈注射預(yù)防后，大鼠血清ALT、AST水平下降，并隨黃芩苷鎂鹽劑量的升高，ALT、AST的下降水平愈加顯著，尤其以50.0 mg/kg、100.0 mg/kg、200.0 mg/kg黃芩苷鎂鹽效果顯著，說(shuō)明黃芩苷鎂鹽具有降低轉(zhuǎn)氨酶的作用，而這種作用與其藥物濃度有關(guān)，具有一定的劑量依賴性。檢測(cè)肝組織MDA水平發(fā)現(xiàn)黃芩苷鎂鹽尾靜脈注射預(yù)防后，黃芩苷鎂鹽可以降低MDA水平，也以50.0 mg/kg、100.0 mg/kg、200.0 mg/kg黃芩苷鎂鹽效果顯著，說(shuō)明黃芩苷鎂鹽可以通過(guò)拮抗肝臟細(xì)胞生物膜的脂質(zhì)過(guò)氧化水平，進(jìn)而保護(hù)肝臟細(xì)胞，其效果也與其藥物濃度有關(guān)，具有一定的劑量依賴性。肝組織病理學(xué)檢查顯示，應(yīng)用黃芩苷鎂鹽預(yù)防后，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞有明顯改善，氣球樣變明顯減輕，其檢查結(jié)果與血清肝功能及肝組織的MDA檢查結(jié)果相一致。以上研究結(jié)果綜合說(shuō)明黃芩苷鎂鹽對(duì)CCl4急性肝損傷大鼠具有良好的預(yù)防保護(hù)作用，并且黃芩苷鎂鹽對(duì)CCl4急性肝損傷大鼠的保護(hù)作用具有一定的劑量依賴性。

異甘草酸鎂是肝細(xì)胞的一種保護(hù)劑，能夠抗炎、改善肝功能、保護(hù)肝細(xì)胞膜。研究表明異甘草酸鎂對(duì)D-氨基半乳糖引起的急性肝損傷具有防治作用，能減輕肝細(xì)胞壞死、炎細(xì)胞浸潤(rùn)，其機(jī)制可能與異甘草酸鎂抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，保護(hù)機(jī)體抗氧化酶活性，提高肝細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性有關(guān)〔9〕。異甘草酸鎂對(duì)CCl4誘導(dǎo)的慢性肝損傷具有治療效果，可以改善肝功能，減輕纖維化程度，其機(jī)制可能與異甘草酸鎂下調(diào)脯氨酰羥化酶的活性，減少膠原合成；降低一氧化氮(NO)水平，抑制CCl4引起的氧化性肝損傷有關(guān)〔10〕。異甘草酸鎂對(duì)于免疫性肝損傷也具有一定的保護(hù)作用，因此本研究選用異甘草酸鎂作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。研究結(jié)果顯示，50.0 mg/kg、100.0 mg/kg、200.0 mg/kg黃芩苷鎂鹽對(duì)ALT的降低作用明顯優(yōu)于異甘草酸鎂組，而對(duì)于AST的降低作用12.5 mg/kg、25.0 mg/kg的黃芩苷鎂鹽不及異甘草酸鎂，50.0 mg/kg、100.0 mg/kg、200.0 mg/kg黃芩苷鎂鹽與異甘草酸鎂無(wú)明顯區(qū)別。檢測(cè)MDA水平發(fā)現(xiàn)，12.5 mg/kg、25.0 mg/kg、50.0 mg/kg的黃芩苷鎂鹽不及異甘草酸鎂降低明顯，結(jié)合病理學(xué)檢查結(jié)果，只有黃芩苷鎂鹽達(dá)到100.0 mg/kg，其對(duì)CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷保護(hù)作用才可與異甘草酸鎂相一致。因此，黃芩苷鎂鹽100.0 mg/(kg·d)可以作為治療CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷用藥劑量。