麥冬皂苷D誘導十二指腸平滑肌舒張作用及機制

張建武 孫浪 劉鑫 羅林 李春臣 羅濤 梅雪

(川北醫學院 1藥學院，四川 南充 637100；2麻醉系；3基礎醫學院機能中心)

麥冬皂苷(OP)D對心腦血管和肝、肺具有保護作用，在抗衰老，抗腫瘤，抗炎，提高免疫和鎮咳祛痰等多方面發揮活性作用〔1〕。研究〔2，3〕表明OPD亦有降血糖的作用，臨床上常用于肺燥干咳，津傷口渴，陰虛癆嗽，喉痹咽痛，心煩失眠，內熱消渴，而且可以用于腸燥便秘的治療〔4〕。臨床上對治療胃腸平滑肌過度收縮的藥物主要以西藥為主，如鈣離子通道阻斷藥硝苯地平和抗膽堿藥阿托品等，硝苯地平長期使用可引起負性肌力和負性傳導，而阿托品由于其不良反應較大，在臨床應用中受到一定的限制，因此，開發有效防治胃腸平滑肌痙攣、低毒、低殘留的天然中草藥意義重大〔5〕。本試驗以家兔離體十二指腸平滑肌為研究對象，研究OPD對兔離體十二指腸平滑肌收縮的影響，并使用不同的工具藥探討OPD對離體十二指腸平滑肌產生影響的機制。

1 材料與方法

1.1動物 任意性別的健康四川大白兔(2.5～3.0 kg)，由川北醫學院動物實驗中心提供，實驗動物許可證編號SYXK(川)2013-076。

1.2藥物及試劑 OPD(成都曼斯特生物科技有限公司，純度99.60%，批號：MUST-17022004)；二甲基亞砜(DMSO，北京索萊寶科技有限公司，批號：CAS67-68-5)；肝素(HP，成都市科華化工試劑廠，批號：CAS 9041-08-1)；釕紅(RR，源葉生物科技有限公司，批號：CAS11103-72-3)；左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME，碧云天生物技術有限公司，產品批號：S0006)；鹽酸維拉帕米注射液(上海禾豐制藥有限公司，批號：43161001)。

1.3儀器 兔類通用實驗器械；BL-420生物機能實驗系統(四川成都泰盟公司)；FT-100生物張力傳感器(四川成都泰盟軟件有限公司)；HW-400E 恒溫平滑肌槽(四川成都泰盟科技有限公司)；優普純水/超純水制造系統(四川優普超純科技有限公司)。

1.4OPD溶液的配置 稱取OPD 0.1 mg，先加1 ml DMSO充分溶解，再加入9 ml臺氏液，將其配成濃度為117 μmol/L的OPD溶液。

1.5家兔十二指腸平滑肌制備 取健康家兔，禁食24 h，用木槌猛擊兔頭枕部致死，迅速沿腹中線打開腹腔，每只家兔取十二指腸同一腸段，置于盛有室溫臺氏液的燒杯中，洗凈腸內容物，之后將其剪成1～2 cm的腸管作為實驗標本。

1.6腸管收縮活動的記錄 打開 BL-420E生物機能實驗系統，調零，定標，在1通道輸入接口處連接張力換能器。調節恒溫平滑肌槽，使水溫保持在 (37±0.5)℃，將臺式液加入預管內，藥物管加入18 ml臺氏液。將標本一端固定于 L 型通氣鉤上，另一端連接張力換能器，持續通入混合氣體(95% O2+5% CO2)，每秒1～2個氣泡，標準負荷1 g，平衡1 h，待腸管運動穩定后，開始進行試驗。

1.7OPD對小腸平滑肌的影響

1.7.1OPD對家兔離體十二指腸平滑肌收縮的影響 待腸管收縮穩定達到實驗要求后，累積加入已配好的OPD使其終濃度分別達到0.65×10-6mol/L(低濃度組)、1.30×10-6mol/L(中濃度組)，1.95×10-6mol/L(高濃度組)，加藥間隔為8 min(每只腸管待其穩定時開始加藥)，同時設置空白組，僅用含相同濃度DMSO的臺氏液進行實驗。觀察腸道運動曲線的變化，用區間測量法測量加藥前1 min和加藥后第8 min的腸道收縮數據(平均收縮力、收縮振幅和收縮頻率)。

1.7.2工具藥預處理后OPD對家兔離體十二指腸平滑肌收縮作用的影響 待腸管收縮曲線穩定達到實驗要求后，分別加入RR 10 μmol/L(RR組)，HP 50 mg/L(HP組)，L-NAME 100 μmol/L(L-NAME組)，維拉帕米0.1 μmol/L(維拉帕米組)，均孵育15 min后，再累積加入OPD使其終濃度分別達到0.65×10-6、1.30×10-6、1.95×10-6mol/L，加藥間隔為8 min，記錄加入OPD后腸管收縮的相關數據。

1.8統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、單因素方差。

2 結 果

2.1OPD對家兔離體十二指腸平滑肌收縮活動的影響 加藥后與加藥前比較，低、中、高濃度組平均收縮力，中、高濃度組振幅均顯著降低(P<0.05,P<0.01)。空白組加藥前后各指標差異無統計學意義(P>0.05)。低、中、高濃度組加藥前、后頻率差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2RR、HP、L-NAME及維拉帕米預處理對OPD舒張十二指腸平滑肌的影響 與對照組比較，RR組及HP組平滑肌收縮力差異無統計學意義(P>0.05)。OPD 1.30×10-6mol/L及OPD 1.95×10-6mol/L時，與對照組比較，L-NAME組平滑肌收縮力均顯著升高(P<0.05,P<0.01)；OPD 0.65×10-6、1.30×10-6、1.95×10-6mol/L濃度時，與對照組比較，維拉帕米組平滑肌收縮力顯著降低(P<0.01)。見表2。

表1 OPD對家兔離體十二指腸平滑肌收縮活動的影響

與加藥前比較：1)P<0.05，2)P<0.01

表2 各組平滑肌收縮力比較

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

3 討 論

胃腸動力紊亂性疾病(DGIM)、胃腸平滑肌功能紊亂、腸易激綜合征的診斷以運動檢測指標為基礎，其運動障礙可以是胃腸本身的功能異常，也可能是其他系統疾病的結果。DGIM 患者往往存在著神經或肌肉解剖異常或生化及神經傳導異常及腸道測壓或腸道電活動的異常〔6〕。相關研究表明，小腸平滑肌毒蕈堿樣膽堿能受體平衡的變化、L-型鈣離子通道活力改變及Cajal間質細胞網絡和數量的改變在小腸平滑肌功能紊亂發病機制中有重要意義，其中毒蕈堿樣膽堿能受體，M1 受體主要通過鳥苷酸結合蛋白(G)g作用于磷脂酸肌醇系統激活磷脂酶C，生成三磷酸肌醇(IP3)和二脂酰甘油(DAG)，從而引起平滑肌的收縮〔7〕。

Chen等〔8〕研究表明OPD可緩解高脂飲食誘導的代謝綜合征，并改變小鼠腸道微生物群的結構，本實驗采用了多種工具藥進行實驗機制的探究，其中HP可作用于IP3受體(IP3R)，IP3R 是廣泛存在于各種細胞內質網的一種鈣釋放通道家族。當IP3R與 1，4，5 IP3和鈣離子兩種底物分子結合后，IP3R開放，鈣離子便從內質網鈣庫釋放到細胞質中〔9〕。本實驗結果表明OPD作用途徑與阻斷IP3R導致平滑肌收縮途徑無必然聯系。

雷諾定受體(RyR)是存在于肌細胞肌質網和其他細胞內質網的胞內鈣釋放通道之一，鈣離子集合后激活RyR1使通道在開放和關閉狀態隨機轉換；進一步集合咖啡因則可將通道保持在開放狀態。Ryanodine 結合于孔道側壁，低濃度時可將通道鎖定在亞電導狀態(有部分離子流通過)，高濃度則阻斷離子的通過〔10〕。為此，本實驗用RR預處理兔離體十二指腸平滑肌，結果表明Ryanodine與IP3R并未介導OPD對十二指腸平滑肌的舒張作用。

神經遞質一氧化氮(NO)通過激活平滑肌細胞內的鳥苷酸環化酶，使胞質內環磷鳥苷(cGMP)濃度增高，鈣離子濃度下降，誘導胃腸平滑肌的舒張〔11～13〕。本實驗預先用L-NAME處理離體十二指腸平滑肌，結果表明OPD可能是通過激活平滑肌細胞內的鳥苷酸環化酶從而誘導了平滑肌的舒張。

Qian等〔14〕實驗證明，OPD對人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)有一定的保護作用，其機制是：穩定線粒體膜電位，減少鈣離子內流。此外，蔣鳳榮等〔15〕實驗也證明OPD能穩定線粒體膜電位，降低細胞通透性，防止鈣離子內流增加，從而保護內皮細胞免于凋亡。本實驗用工具藥維拉帕米對離體小腸進行預孵，其作用機制是阻滯外源性鈣離子經L-型鈣離子通道進入細胞內，降低胞內的鈣離子濃度，而鈣離子是細胞內重要的第二信使，高濃度的鈣離子可引起平滑肌收縮，低濃度鈣離子可引起平滑肌舒張〔16〕，本實驗結果表明OPD可能是通過抑制細胞的外鈣內流從而引起離體家兔十二指腸平滑肌的舒張作用。

綜上所述，OPD可濃度依賴性地抑制自發性腸平滑肌的收縮作用，作用機制可能為通過阻斷L-型鈣通道，抑制外鈣內流最終導致細胞內鈣離子濃度降低，從而降低了平滑肌的收縮作用，此外，OPD也有可能是通過激活平滑肌細胞內的鳥苷酸環化酶從而誘導了平滑肌的舒張。