燈盞乙素調節ATP敏感性鉀通道對抗β-淀粉樣蛋白的毒性作用

王寧慧 伍棋 于燕妮 郭莉莉

(1貴州醫科大學，貴州 貴陽 550004；2貴陽市第一人民醫院)

阿爾茨海默病(AD)的病理機制與β-淀粉樣蛋白(Aβ)的多個神經毒性機制密切相關，這些毒性機制之間相互影響，互為調節，形成一個復雜的多因素循環作用，貫穿在整個疾病進程中。Aβ作為疾病致病分子的認識多年來得到公認，雖然針對Aβ設計的靶向臨床藥物并未取得治療上的突破，然而研究者們卻得到了在治療上應針對Aβ毒性而非單純針對Aβ本身的重大提示〔1,2〕。致力于多個靶點的毒性對抗，降低Aβ神經毒性以期延緩AD進程，仍然是AD的主要治療策略之一。課題組利用同位素標記相對和絕對定量(iTRAQ)技術獲取了AD雙轉基因動物腦組織中Aβ毒性相關的差異蛋白點，同時觀察到燈盞乙素(Scu)主要調節了其中12個差異靶蛋白點的療效，包括ATP敏感性鉀通道(KATP)蛋白〔3〕。分化成熟的人源性神經母細胞瘤(SH-SY5Y)細胞具有神經元的形態和特性，并表達神經元特異性標志物，往往被用來制作神經系統疾病的細胞模型〔4〕，本實驗利用該細胞株制作Aβ毒性誘導的反映AD病程的細胞模型，進一步驗證并探討Scu介導KATP路徑對抗Aβ神經毒性的療效及作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗藥物及細胞 實驗Scu為淺棕色粉末(批號：ZL20161012037，純度98%)，由南京澤朗生物醫藥科技公司提供；Aβ1～42寡聚體購自Sigma公司(編號：A9810)；二氮嗪(DZ)購自Sigma公司(編號：D9035)；SH-SY5Y細胞購自中國科學院昆明細胞生物研究所(編號：KCB2006107YJ)。

1.2主要試劑與儀器 CCK8試劑購自同仁公司(日本)；多克隆兔抗Kir6.1購自GenTex公司(美國)；多克隆兔抗Kir6.2、SUR1、SUR2購自Abcam公司(美國)；β-actin抗體購自CST公司(美國)；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；DiBAC4(3)熒光探針購自北京索萊寶科技有限公司；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)和ATP檢測試劑盒購自碧云天生物技術公司。多功能酶標儀(美國Thermo Fisher公司)；流式細胞儀(美國Beckman Couler公司)；蛋白質凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.1藥物制備 Aβ1～42用六氟異丙醇(HFIP)進行充分溶解并分裝，通風櫥過夜風干，-80℃保存待用，使用前加二甲基亞砜(DMSO)溶解， 用不含酚紅的DMEM/F12細胞培養液稀釋成每管10 μmol/L，4 ℃冰箱放置24 h，離心后取上清使用〔5〕；Scu和DZ 在使用前精確稱量分裝，再用DMEM細胞培養液充分稀釋，0.22 μm微孔注射濾器過濾后使用。

1.3.2細胞培養及分組處理 SH-SY5Y細胞培養，培養液為DMEM高糖培養基，添加12%胎牛血清，1%雙抗，培養箱條件為37℃、5% CO2，將細胞轉入細胞培養板中，分為對照組、Scu處理組、Aβ處理組、Scu+Aβ處理組、DZ+Aβ處理組。對照組不加藥物處理；Scu處理組加入Scu(10 μmol/L)培養48 h；Aβ處理組加入Aβ1～42(1 μmol/L)培養24 h；Scu+Aβ處理組、DZ+Aβ處理組分別加入Scu(10 μmol/L)、DZ培養24 h，再加入Aβ1～42(1 μmol/L)培養24 h。

1.3.3CCK-8法篩選藥物濃度 將細胞以1×105個/ml的密度接種于96孔板，每孔100 μl，單加磷酸鹽緩沖液(PBS)作為陰性對照，細胞貼壁后進行不同濃度DZ(0、100、200、250、500、1 000、2 000 μmol/L)的加藥處理，繼續培養48 h后加入CCK-8試劑，CCK-8試劑用DMEM細胞培養液以1∶10 的比例稀釋后，每孔100 μl均勻加入，放置培養箱孵3 h后用多功能酶標儀測定450 nm處OD值，根據公式存活率=(實驗組-空白組)/(對照組-空白組)計算各組細胞存活率。Aβ及Scu的濃度同之前的檢測方法和結果〔6〕。

1.3.4生物化學方法檢測各組ATP含量 將細胞接種于6孔板中，24 h貼壁后進行分組處理。各組細胞分別加入200 μl/孔的裂解液裂解細胞，4℃ 12 000 r/min離心5 min，取上清待用。將100 μl/孔 ATP檢測工作液加入96孔板中，室溫放置3～5 min，再加入上述上清或標準品，多功能酶標儀(化學發光)檢測，根據標準曲線計算樣品中ATP含量。

1.3.5Western印跡檢測各組細胞KATP通道亞基內向整流鉀通道(Kir)6.1、Kir6.2、磺酰脲受體(SUR)1、SUR2的蛋白表達水平 收集各組細胞，加入蛋白裂解液，4℃裂解1 h，4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，取上清并進行BCA蛋白定量，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉于PVDF膜上，各指標一抗和二抗孵育后曝光顯影。以β-actin蛋白作為內參照，用ImageJ 軟件對圖像進行灰度分析，結果以各指標條帶與β-actin條帶灰度的比值作為各指標蛋白的相對表達量。

1.3.6DiBAC4(3)熒光探針法檢測各組細胞細胞膜電位 將細胞以1×105個/ml的密度接種于96孔板中，24 h細胞貼壁后進行分組處理后分別加入180 μl的5 μmol/L DiBAC4(3)的檢測用緩沖液，在5%CO2，37℃培養箱中孵育30 min，孵育結束后再加入20 μl的5 μmol/L DiBAC4(3)的檢測用緩沖液，用多功能酶標儀(激發光488 nm，發射光517 nm，孵育溫度37℃)觀察各組細胞的熒光強度變化。

1.3.7JC-1熒光探針法檢測各組細胞線粒體膜電位 將細胞以1×105個/ml的密度接種于96孔板中，24 h細胞貼壁后進行分組處理。各組細胞分別加入50 μl/孔細胞培養液和50 μl/孔JC-1染色工作液，充分混勻，細胞培養箱37℃孵育20 min，孵育結束后吸除上清，用JC-1染色緩沖液洗滌2次，最后加入100 μl/孔細胞培養液，多功能酶標儀檢測JC-1聚合體(激發光525 nm，發射光590 nm)和JC-1單體(激發光490 nm，發射光530 nm)熒光值，線粒體膜電位用JC-1單體熒光值/JC-1聚合體熒光值作為相對比值進行計算統計。

1.3.8流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率 將細胞接種于6孔板中，24 h貼壁后進行分組處理。用不含EDTA的胰酶(200 μl/孔)消化收集細胞，PBS洗滌細胞兩次后，用500 μl上樣緩沖液懸浮細胞，再依次加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶混勻，室溫避光放置15 min，在1 h內采用流式細胞儀進行凋亡檢測，利用Flow-Jo流式分析軟件，計算細胞總凋亡率。

1.4統計學方法 采用SPSS21.0 軟件進行單因素方差分析和秩和檢驗。

2 結 果

2.1不同濃度DZ對SH-SY5Y細胞增殖活性的影響 濃度為0、100、200、500、1 000、2 000 μmol/L的DZ作用于SH-SY5Y細胞48 h后的細胞存活率分別為(100.00±0.00)%、(103.47±8.16)%、(92.36±3.38)%、(65.32±3.75)%、(48.81±4.26)%、(30.31±5.54)%。0～200 μmol/L DZ作用于細胞48 h后細胞增殖活性無明顯變化，500～2 000 μmol/L作用后細胞的增殖活性呈不同程度的下降，毒性作用呈劑量-效應關系，差異有統計學意義(P<0.01)，選擇200 μmol/L作為DZ實驗用濃度。

2.2各組細胞ATP含量 與對照組〔(9.57±0.62)nmol/mg〕和Scu處理組〔(9.86±1.18)nmol/mg〕相比，Aβ處理組〔(6.84±0.68)nmol/mg〕ATP含量明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)；Scu干預后〔Scu+Aβ處理組(8.78±0.73)nmol/mg〕，ATP含量有所升高，差異有統計學意義(P<0.05)；DZ干預后〔DZ+Aβ處理組(7.22±0.30)nmol/mg〕，ATP含量也有所升高，但差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3Kir6.1、Kir6.2、SUR1、SUR2的蛋白表達 與對照組和Scu處理組相比，Aβ處理組Kir6.1、SUR2的蛋白表達上調，差異有統計學意義(P<0.01)，Kir6.2、SUR1的表達無明顯變化；Scu干預后，Kir6.1、SUR2的蛋白表達下調，差異有統計學意義(P<0.01)，未見Kir6.2、SUR1的表達變化。DZ+Aβ處理組的表現與Scu+Aβ處理組基本一致。見表1，圖1。

1～5:對照組;Scu處理組;Aβ處理組；Scu+Aβ處理組；DZ+Aβ處理組圖1 各組細胞中Kir6.1、Kir6.2、SUR1、SUR2蛋白表達水平

組別Kir6.1Kir6.2SUR1SUR2對照組0.65±0.060.86±0.060.53±0.060.68±0.05Scu 處理組0.64±0.140.86±0.160.54±0.090.66±0.12Aβ處理組1.09±0.231)0.84±0.060.55±0.031.02±0.081)Scu+Aβ處理組0.74±0.122)0.88±0.140.56±0.050.76±0.072)DZ+Aβ處理組0.67±0.162)0.85±0.120.57±0.050.77±0.102)

與對照組比較：1)P<0.01；與Aβ處理組比較：2)P<0.01

2.4各組細胞細胞膜電位變化 與對照組(6.86±0.05)和Scu處理組(6.79±0.05)相比，Aβ處理組(7.38±0.14)的熒光值有所升高，差異有統計學意義(P<0.05)，表示細胞膜膜電位升高，呈現去極化現象；而與Aβ處理相比，Scu+Aβ處理組(6.86±0.20)的熒光值趨向于正常，但差異有統計學意義(P<0.05)，表示膜電位的去極化現象有所改善。DZ+Aβ處理組(6.90±0.33)的表現與Scu+Aβ處理組基本一致。

2.5各組細胞線粒體膜電位變化 與對照組(1.03±0.07)和Scu處理組(1.03±0.04)相比，Aβ處理組(1.43±0.02)的熒光值有所升高，但差異仍有統計學意義(P<0.01)，表示細胞膜膜電位升高，呈現去極化現象；而與Aβ處理相比，Scu+Aβ處理組(1.23±0.05)的熒光值趨向于正常，但差異仍有統計學意義(P<0.01)，表示膜電位的去極化現象有所改善。DZ+Aβ處理組(1.22±0.04)的表現與Scu+Aβ處理組基本一致。

2.6各組細胞總凋亡率 與對照組(4.18%±0.63%)和Scu處理組(4.25%±0.42%)相比，Aβ處理組(17.58%±0.48%)細胞總凋亡率明顯增加，差異有統計學意義(P<0.01)；Scu干預后，細胞總凋亡率(11.23%±0.84%)明顯下降，差異有統計學意義(P<0.01)。DZ+Aβ處理組(9.67%±1.03%)的表現與Scu+Aβ處理組基本一致。

3 討 論

KATP是一種與細胞能量代謝密切相關的配體門控鉀通道，受腺苷酸的調節直接將細胞的代謝狀態與電活動相耦聯，在神經系統中起神經元保護作用〔7〕。細胞內ATP是KATP通道的主要調節劑，通道的開閉直接受其調控，正常細胞胞質內ATP濃度約為10 nmol/mg蛋白，此時KATP處于穩定狀態，當細胞受到內外環境刺激時，胞質內ATP濃度發生適應性下降，觸發KATP開放。細胞膜上的KATP開放時，K+外流，細胞膜超極化，抑制細胞膜上電壓依賴性離子通道的開放，比如抑制電壓依賴性鈣離子通道，可減少鈣內流，減少細胞內鈣超載誘發的凋亡，同時也能減少動作電位的發生，減少能量消耗；線粒體膜上的KATP開放時，線粒體膜超極化，可維持線粒體膜電位，穩定線粒體體功能，抑制線粒體通透性轉換孔(MPTP)的開放，減少氧自由基和凋亡啟動因子釋放，進而減少氧化應激損傷和凋亡發生〔8〕。我們在實驗中發現，Aβ的毒性刺激使細胞內ATP的濃度明顯下降，細胞膜和線粒體膜電位呈現去極化改變，表明Aβ刺激了ATP調節下的KATP開放，神經元細胞發生保護性自主調節的生物學行為，然而，細胞凋亡率的增加，代表這種適應性反應遠不足以抵消Aβ造成的細胞損傷。

KATP主要分布在神經元、胰腺β細胞、骨骼肌細胞及平滑肌細胞的細胞膜和線粒體膜表面，由4種Kir和4種SUR組成，Kir家族形成通道孔，Kir6為ATP敏感，目前確定的有Kir6.1和Kir6.2兩種亞基，SUR為ATP結合蛋白的“超家族”，構成通道調控元件，包括SUR1和SUR2兩種亞基。研究發現，KATP通道亞基在腦內廣泛表達(包括在與認知能力密切相關的海馬區域，海馬區主要以Kir6亞基表達為主)〔9〕，我們同樣觀察到實驗用神經元細胞中均呈現出Kir6.1、Kir6.2、SUR1和SUR2的蛋白表達，且Aβ的處理引起了Kir6.1和SUR2的蛋白表達上調，對Kir6.2和SUR1的蛋白表達并無影響，代表Aβ觸發的KATP通道開放選擇性作用于Kir6.1/SUR2亞基。與此同時，我們觀察到在Scu干預后，Aβ刺激下細胞內ATP的濃度水平與細胞膜和線粒體膜電位的變化趨向于正常，Kir6.1和SUR2的蛋白表達下調，細胞總凋亡率明顯下降，顯示出Scu可能通過調節KATP通道蛋白Kir6.1/SUR2亞基的表達，或者是降低KATP通道對細胞內ATP的敏感性而激活了通道開放，在Aβ的毒性影響下發揮神經元保護作用。

KATP通道現已成為包括神經變性性疾病在內的多種疾病的治療靶點，多種KATP通道開放劑(KCOs)被應用于臨床并取得較好療效，不同類型的KCOs通過不同方式選擇性作用于KATP通道蛋白〔10〕。二氮嗪(DZ)作為KCOs的一種類型被證實可以用來延緩Aβ毒性導致的細胞損傷〔11〕，有研究顯示其可激活心肌細胞膜上的Kir6.1/SUR2亞型KATP通道來介導對心肌缺血再灌注損傷的保護，實驗中DZ對ATP濃度的影響無統計學意義，可能與其主要是增加細胞內二磷酸腺苷(ADP)的濃度有關。我們觀察到Scu發揮了與DZ基本相一致的作用，提示Scu存在作為KCOs應用來降低Aβ毒性的可能。

課題組在同期實驗中觀察到，Scu能夠通過干預APP代謝的β分泌酶途徑來抑制Aβ的生成〔12〕；能夠通過對IP3R-Ca2+途徑的調控和介導MPTP的開放來抑制Aβ毒性所致的細胞凋亡〔13〕；能夠調節Aβ毒性所致神經元中組蛋白H2A、H2B、H3的表達，通過改變AD表觀遺傳的信息異常來發揮預防和治療作用〔14〕等。綜上所述，我們推測其還可能通過調控ATP介導的KATP通道開放來抑制Aβ毒性所致的細胞凋亡，從而發揮神經元保護作用，本實驗為藥物針對Aβ毒性在AD治療中產生積極影響提供了新的實驗依據。