釓貝葡胺合成中間體BOPTA有關物質的制備及結構鑒定

方欽虎 沈偉藝 曾德云 郭鵬飛

摘 要：目的：對合成釓貝葡胺的中間體BOPTA工藝中所含的未知雜質進行了分離純化和結構鑒定。方法：基于制備液相色譜，優化色譜分離參數，通過兩步分離純化，制備BOPTA及其2個未知雜質。借助質譜和核磁技術對雜質結構進行結構表征。結果：2個未知雜質結構鑒定為 2，2-（1，9-dicarboxy-12-phenyl-11-oxa-2，5，8-triazadodecane-5，8-diyl）diacetic acid（雜質1）、4-carboxy-8-（carboxymethyl）-1-phenyl-2-oxa-5，8，11-triazatridecan-13-oic acid（雜質2）。結論：本研究為藥物及醫藥合成中間體雜質的分離純化和結構鑒定提供借鑒。

關鍵詞：釓貝葡胺；BOPTA；制備液相色譜；分離純化；雜質

中圖分類號：TQ421.3+6 文獻標識碼：A 文章編號：1671-2064（2019）11-0195-02

0 引言

釓貝葡胺的合成工藝是以BOPTA（4-羧基-5，8，11-三（羧甲基-1-苯基-2-氧雜-5，8，11-三氮雜十三烷-13-酸））為原料，與三氧化二釓發生絡合反應得到釓貝酸，再投入葡甲胺絡合得到[1]。BOPTA是釓貝葡胺合成的關鍵中間體，在其質量控制方面起著重要作用。雜質產生機理，雜質結構確證和雜質限量控制已經成為藥品質量的重要研究內容[2]。對于雜質的研究，目前常利用現代儀器設備和各種分析表征手段對雜質進行富集、純化制備和結構鑒定。目前對于BOPTA生產工藝中產生的雜質仍沒有被報道。高效液相色譜法（HPLC）是目前制藥領域廣泛使用的分離分析技術[3-6]。HPLC采用粒度均勻的小顆粒填料和自動化儀器，具有高柱效、重復穩定和在線監測等優點。施猛等人使用HPLC對于釓貝葡胺注射液中葡甲胺的含量進行了研究[7]。本文基于制備液相色譜技術，通過兩步制備方法，獲得BOPTA和2個相關雜質，并對雜質進行了純度分析、質譜和核磁的結構表征。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

磷酸二氫鉀（純度≥99.0%）購于上海泰坦科技股份有限公司；制備級乙腈購于上海星可高純溶劑有限公司；HPLC級磷酸、乙腈購自中國百靈威公司；實驗用水由Milli-Q純化系統（美國Millipore公司）制備；BOPTA粗品由浙江司太立制藥股份有限公司車間合成。

BOPTA樣品分析及方法優化采用Waters Alliance e2695高效液相色譜儀，包括四元梯度泵、自動進樣器、2489 UV/Visible檢測器、在線脫氣機、柱溫箱和EmpowerTM 3.0色譜工作站（美國Waters公司）；分離純化采用Waters純化系統包括2545二元梯度泵、2489 UV/Visible檢測器、2767餾分收集模塊和Masslynx 4.1操作軟件；高分辨質譜采用Agilent HPLC1260-QTof 6520液質聯用儀；核磁表征在Bruker AVANCE III-600 MHz超導核磁共振波譜儀完成。分析柱Unitary C18和XAqua（250mm×4.6mm，5μm）、制備柱Unitary C18和XAqua C18（250mm×20mm，10μm）購于浙江華譜新創科技有限公司。

1.2 純化制備

BOPTA樣品加水溶解，濃度為300mg/mL。在制備柱XAqua C18（250mm×20mm，10μm）上進行初次分離。采用20mM磷酸二氫鉀（pH=3.0）（A）-乙腈（B）為流動相，梯度洗脫0-30min，7-18%B，流速20mL/min，進樣體積1mL，檢測波長215nm。經初次制備共獲得3個餾分，記為Fr 1～Fr 3。

餾分Fr1～Fr3經濃縮后，在Unitary C18制備柱上進行二次純化。以20 mM 磷酸二氫鉀（pH=3.0）（A）-乙腈（B）為流動相等度洗脫。餾分經濃縮、脫鹽、凍干處理，共獲得Fr 1-1（impurity 1，54.8mg），Fr 2-1（impurity 2，64.7mg），Fr 3-1（BOPTA，800.5 mg），。通過純度分析、高分辨質譜、1H-NMR和13C-NMR表征確定化合物的結構（圖1）。

2 結果與討論

在4.6mm內徑的分析柱上進行條件優化后，在20mm的制備柱上開展放大制備實驗。初次制備條件見1.2節，制備圖如圖2（A）所示，獲得餾分Fr.1～Fr.3。盡管一次洗脫液中雜質成分純度較低，但組分較為簡單，便于二次制備高純度雜質。餾分采用低溫旋蒸脫去有機溶劑，再進行第二次純化。由于成分相對簡單，實驗采用了等度洗脫條件和連續進樣方式，提高了制備效率。以餾分Fr 2為例，單針運行時間為20min，而采用連續進樣方式，進樣間隔分別為13min。單位時間內（100min），制備效率提高了1.6倍。圖2（B）為連續制備圖，圖中紅色箭頭表示進樣時間點。通過二次分離純化，從BOPTA樣品中制備獲得BOPTA和2個相關物質。

3 結構表征

制備所得化合物經過純度分析、質譜、1H-NMR和13C-NMR進行結構表征。純度分析結果：雜質1（99.1%）、雜質2（98.2%）和BOPTA（99.2%）。

雜質1：白色粉末，UV λmax 205nm，ESI-MS m/z： 454.1899 [M-H]-，結合1H-和13C-NMR譜數據推測分子式為C20H29N3O9，1H-NMR（600MHz，D2O）δ：7.45（5H，m， H16-20），4.61（6H，m，H5-7）.13C-NMR（150MHz，D2O）δ：169.9（C-1），169.2（C-2），163.9（C-3），167.6（C-4），53.9（C-5），59.7（C-6），60.4（C-7），65.7（C-8），65.1（C-9），73.3（C-10），41.0（C-11），55.2（C-12），51.7（C-13），42.2（C-14），136.8 （C-15），128.7（C-16），128.9（C-17），128.6（C-18），128.9（C-19），128.7（C-20）.鑒定該化合物為2，2-（1，9-dicarboxy-12-phenyl-11-oxa-2，5，8-triazadodecane-5，8-diyl）diacetic acid。

雜質2：白色粉末，UV λmax 205nm，ESI-MSm/z： 396.1892 [M-H]-，結合1H-和13C-NMR譜數據推測分子式為C18H27N3O7，1H-NMR（600MHz，D2O）δ：7.40（5H，m，H14-18），4.39（1H，s，H-6）.13C-NMR（150MHz，D2O）δ：169.4（C-1），169.2（C-2），166.0（C-2），47.9（C-4），55.3（C-5），66.2（C-6），66.7（C-7），73.26（C-8），43.1（C-9），53.4（C-10），55.7（C-11），42.9（C-12），136.7（C-13），128.5（C-14），128.8（C-15），128.5（C-16），128.8（C-17），128.5（C1-8）.鑒定該化合物為4-carboxy-8-（carboxymethyl）-1-phenyl-2-oxa-5，8，11-triazatridecan-13-oic acid。

BOPTA：白色粉末，UV λmax 205nm，ESI-MS m/z： 512.1903[M-H]-，結合1H-和13C-NMR譜數據推測分子式為C22H31N3O11，1H-NMR（600MHz，D2O）δ：7.36（5H，m，H18-22），4.12（1H，s，H10），3.41-3.18（8H，m，H13-16）.13C -NMR（150MHz，D2O）δ：170.5（C-1），170.5（C-2），172.5（C-3），171.1（C-4），172.1（C-5），56.1（C-6），56.1（C-7），54.3（C-8），53.9（C-9），66.6（C-10），66.0（C-11），73.2（C-12），51.6（C-13），50.8（C-14），51.2（C-15），50.0（C-16），136.9（C-17），128.5（C-18），128.8（C-19），128.4（C-20），128.8（C-21），128.5（C-22）。鑒定該化合物為BOPTA。

4 結語

在藥物合成反應過程中不可避免地會產生雜質，故研究合成產物的雜質，有利于了解合成過程與方法的合理性，以期對工藝進行評估和改進，從而對于藥物的安全性提供保障。本實驗基于制備液相色譜法，以BOPTA粗品為原料，優化色譜分離純化參數，并放大到制備水平，采用兩步純化方法制備了BOPTA和2個相關雜質，為其質量控制奠定基礎。

參考文獻

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