花胚胎發育觀察

王 靜， 方富貴， 孟 軻， 喬劉鑫， 孔浩強， 郭 晗， 張益民， 劉慧芬， 李學軍

（河南師范大學水產學院河南省水產動物養殖工程技術研究中心河南新鄉453007）

花鰭骨（Hemibarbus maculatusBleeker）隸屬于鯉形目（Cypriniformes）、鯉科（Cyprinidae）、鮈亞科（Gobioninae）、鰭骨屬（Hemibarbus），俗稱花骨魚、季郎魚，分布廣，肉質細嫩，味道鮮美，蛋白質含量高，深受消費者喜愛。近年來，隨著消費需求的增長，我國各地陸續開展了花鰭骨的人工繁殖，食性、營養等方面的研究，對胚胎發育的研究較少，因此本實驗進行了觀察和記錄，旨在對花鰭骨早期生活史進行初步探討，從而為其苗種生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 親魚來源與培育

親魚來自鄭州市黃河濕地繁育場，暫養于水泥池，采用自然水溫流水培育，用沉性顆粒飼料和甲魚料按一定比例混合投喂，期間適當添加復合維生素，日投喂3 次，培育3個月。

1.2 人工授精和孵化

2019年5月進行人工催產，使用馬來酸地歐酮（domperidon DOM） 和促黃體素釋放激素類似物（Luteinzing Hormone Releasing Hormone -analogue LRH-A2）。雌魚催產藥物用量為每千克體重1 mg 的DOM和2 μg的LRH-A2，雄魚劑量減半，注射于胸鰭基部。采用干法人工授精，每2尾雌魚卵子與1尾雄魚精液結合，將受精卵撒入網箱內，靜水孵化。孵化期間水溫控制在24 ℃～26 ℃，及時清除死卵，防止水霉發生。

1.3 胚胎發育處理

花鰭骨產粘性卵，遇水后膨脹，表面由一層膜包被，使胚胎不易觀察。采用三種方法對胚胎進行處理觀察：

（1）用4% 的多聚甲醛固定, 卵膜透明后置于生理鹽水中，用尖頭鑷子剝去卵膜，拍照觀察；

（2）受精后的胚胎立即用滑石粉脫粘，清水洗滌數次，至水溶液澄清后拍照；

（3）將受精卵直接灑在盛有蒸餾水的培養皿里，顯微鏡下觀察。

1.4 胚胎發育觀察

參照《水產動物組織胚胎學》的方法[2]，將受精卵用吸管均勻灑在裝有蒸餾水的培養皿中，每個時期選取30個樣本，發育時序以50%的胚胎發育至某個時期的時間計算，用蔡司倒置顯微鏡進行拍照觀察。

2 結果與分析

2.1 花鮚骨胚胎發育觀察方法比較

因花鰭骨為粘性卵，遇水后粘性增大，產生不透明的卵膜，因此在胚胎發育觀察中存在難題，3種胚胎處理方法顯示，將受精卵直接置于蒸餾水中，透明度高，拍照效果最好（圖1-3）；而經滑石粉脫粘后，外部附著顆粒，致使卵膜灰黑，不易觀察（圖1-2）；用4%多聚甲醛固定后，雖然內部結構清晰可見，但死亡后的胚胎用尖頭鑷子剝去卵膜，內含物易流出，形態結構易發生改變，無法得到完整的胚胎（圖1-1）。因此本實驗觀察花鰭骨的胚胎發育采用不脫粘的受精卵，蒸餾水孵化。

圖1 胚胎觀察不同前處理方法Fig.1 Different methods of embryo pretreatment were observed

2.2 胚胎發育過程

根據顧若波[1]前期對花鰭骨胚胎發育的研究，結合實驗觀察，水溫控制在24 ℃，將其分為受精卵形成時期、卵裂時期、囊胚時期、原腸胚時期、神經胚期時期、器官形成期、出膜期（表1）。

表1 花鮮骨胚胎各期發育特征Table.1 Embryonic development characteristic periods of Hemibarbus maculatus

2.2.1 受精卵形成時期花鰭骨受精卵呈卵圓形，卵徑為2.43 mm-3.44 mm，亞麥色，成胚盤（圖2-1）。

2.2.2 卵裂時期

受精后1 h 10 min，胚盤從中間一分為二，頂部中央出現1縱裂溝，進入2細胞期（圖2-2）。40 min之后，第2次卵裂開始，4個細胞前后交錯排列為2排，兩兩垂直，即4細胞時期（圖2-3）。受精后2 h 10 min，4細胞分裂成8個細胞，大小相似，整齊排列，分裂面與第1次平行，此時期稱8細胞期（圖2-4）。第4次分裂完成于受精后2 h 40 min，在第2分裂面的兩側產生與之平行的分裂溝，細胞個數為16個，胚盤進入16細胞期（圖2-5）。受精3 h 10 min，細胞進入32細胞期，大小不一，排列不規則（圖2-6）。細胞持續分裂，并且速度加快，數目越來越多，重疊緊密，差異明顯，受精3 h 40 min，發展到64細胞期（圖2-7）。隨后，卵裂向多個方向進行，數量逐漸增多，細胞界限分辨不清，個體越來越小，進入多細胞期（圖2-8）。

2.2.3 囊胚時期

在受精4 h 20 min后，細胞持續分裂，并且越分越細，肉眼難以計數，集聚在胚盤上方形成隆狀結構，進入囊胚早期（圖2-9）。隨著時間的推移，細胞不間斷地分化，隆起細胞與胚盤各占卵的1/2，此時期為囊胚中期，又稱高囊胚期（圖2-10）。之后一段時間，細胞與胚盤界限模糊，胚層開始慢慢下包胚盤，胚盤為橢圓狀，到達囊胚晚期（圖2-11）。

2.2.4 原腸胚時期

受精10 h后，胚層細胞下包卵黃的1/3，可觀察到一個環狀結構稱胚環（圖2-12），是原腸早期的典型特征。受精13 h 30 min后，胚層細胞下包卵黃的1/2時，似在胚盤上方加蓋一帽子，與此同時胚盾出現，到達原腸中期（圖2-13）。胚層細胞繼續下包卵黃的2/3時，胚盾開始伸長，標志著原腸晚期的到來（圖2-14）。

2.2.5 神經胚時期

在受精20 h 40 min后，胚層細胞下包卵黃的4/5時，胚層貼在胚盤上，并且胚環慢慢縮小，進入神經胚時期（圖2-15）。2 h 10 min后胚層細胞完全包住卵黃，胚孔閉合，上端略微突起，為胚孔閉合期（圖2-16）。

2.2.6 器官形成時期

在胚孔閉合35 min后，胚體周圍開始分化，頭部開始突起，四周會依稀出現肌節，包裹著胚體，為肌節形成期（圖2-17）。1 h 5 min后，清晰觀察到四對肌節（圖2-18），25 min后形成八對肌節（圖2-19），隨著發育肌節數增加，進入多肌節期（圖2-20）。在腦部的兩側浮現出眼泡并隆起產生眼肌，稱眼肌期（圖2-21）。眼部邊緣靠近前側形成橢圓狀眼囊，稱眼囊期。在眼的前方有一圓形板狀結構叫嗅板，依附在頭部兩側靠近眼囊，稱嗅板期。進一步觀察發現，胚體尾部微微向上翹起，眼睛擴大，稱尾鰭出現期（圖2-22）。在此基礎上，尾鰭慢慢彎曲為芽狀，肌節25-27對，胚體的形態發生較為明顯的變化，稱尾芽期（圖2-23）。在受精52 h 31 min后，當肌節達到28對時，頭部附近1-3對肌節開始緩慢收縮，稱肌肉效應期（圖2-24）。眼部周圍發現有一透明圓形狀晶體，稱晶體出現期。1 h 17 min后，心臟出現，細長管狀，眼的前部下方有半橢圓狀組織，稱鼻窩期（圖2-25）。肌節30對時，聽囊出現，附帶一對不透明的白色亮點，稱耳石期（圖2-26）。尾部在胚體內占有一半的空間，尾擺的頻率加快，每分鐘5個周期，每個周期擺動3次，并且帶動胚體在膜內順時針轉動，以此循環，稱心臟搏動期（圖2-27,28）。

2.2.7 出膜期

受精66 h后，肌節停止分化達到30對，胚體蜷縮在膜內，轉動5 次/min，心臟跳動6 次/min，尾擺15 次/min，慢慢胚體運動速度加快，從順時針轉動到翻轉、跳躍，卵越來越接近透明，胚體的每個器官依稀清楚可見，卵膜軟化。5 min后胚體尾部穿破卵膜，透出小尾巴，此時刻胚體開始在膜內掙扎，軀干部猛烈抖動，心臟搏動頻率加快，頭部左右搖晃，開始掙脫卵膜的包被束縛，3 min后頭部掙脫出卵膜，2 min后軀干部出膜，仔魚出現稱出膜期（圖2-29,30）。

2.2.8 出膜后發育

仔魚出膜后，眼部積累較多黑色素，為眼球色素出現期（圖2-31）。

圖2 花鮮骨胚胎發育觀察Figure.2 Observing embryonic development of Hemibarbus maculatus

（1）受精卵；（2）2細胞期；（3）4細胞期；（4）8細胞期；（5）16細胞期；（6）32細胞期；（7）64細胞期；（8）多細胞期；（9）囊胚早期；（10）囊胚中期；（11）囊胚晚期；（12）原腸胚早期；（13）原腸胚中期；（14）原腸胚晚期；（15）神經胚期；（16）胚孔閉合期；（17）體節形成期；（18）四肌節期；（19）八肌節期；（20）多肌節期；（21） 眼肌出現期；（22） 尾鰭出現期；（23） 尾芽期；（24）肌肉效應期；（20）晶體出現期；（25）鼻窩期（26）耳石期；（27-28）心臟搏動期；（29-30）出膜期；（31）眼球色素出現期。

(1)fertilized egg;(2)2 cell phase;(3)4 cell phase;(4)8 cell phase;(5) 16 cell phase;(6) 32 cell phase;(7) 64 cell phase;(8) multicellular phase;(9) early blastocyst stage;(10) blastocyst metaphase stage;(11) late blastocyst stage;(12) early gastrula stage;(13) middle gastrula stage;(14)late gastrula stage; (15) neurula stage; (16) blastopore closed stage;(17) appearance of myomere stage;(18) four myomere stage;(19) eight myomere stage;(20) multi-myomere stage;(21)muscle effector phase;(22)caudal fin emergence stage;(23) tail bud stage;(24) muscle response period;(20) appearance of crystal stage;(25) nasal fossa stage (26) otolith stage;(27-28) cardiac pulse period;(29-30) membrane stage;(31) stage of appearance of eye pigment.

3 討論

3.1 花鮚骨胚胎發育觀察處理方法

自然界的魚類的產卵類型可分為3類，浮性卵，能漂浮在水面；沉性卵，卵的比重大于水；粘性卵，遇水后吸附在水草等物體上[3]。常見的四大家魚“青魚（Mylopharyngodon piceus）、草魚（Ctenopharyngodon idellus）、鰱（Hypophthalmichthys molitrix）、鳙（Aristichthys nobilis）”產漂流性卵，而同屬于鯉科魚的花鰭骨則產粘性卵。大多數粘性卵需要經過不同的胚胎觀察前處理，黃金善用甲醛處理虹鱒（Oncorhynchus mykiss）得到較好的效果[4]；柳愛蓮將斑馬魚（Danio rerio）的胚胎用波恩式液固定，瓊脂糖包埋，石蠟切片，觀察早期胚胎發育形態變化[5]。對于花鰭骨粘性卵的處理方法在之前也有報道，顧若波曾嘗試用0.1mol/L的鹽酸溶液短時間浸泡、0.3%的胰蛋白酶處理卵膜和5%甲醛固定，發現3種方法各有弊端，鹽酸處理后效果最好[1]。對本實驗所采用的方法而言，將未經脫粘處理的胚胎置于蒸餾水中，靜水孵化，拍照效果最佳；滑石粉脫粘后，細小顆粒物質包裹卵表面，建議觀察花鰭骨胚胎發育時最好不做脫粘處理，這一點與顧若波的觀點相符合。

3.2 花鮚骨的胚胎發育特點

溫度、光照和溶氧等外界條件都可以影響魚類胚胎發育的過程，在水溫20 ℃左右，似刺鳊鮈（Paracanthobrama guichenoti）受精卵需要95 h 08 min孵化出膜，而溫度在23 ℃-26 ℃時，則需要78 h07 min，溫度越高孵化時間越短[6]。這一現象也出現在花鰭骨水溫18 ℃時，花鰭骨受精卵出膜需要110 h；水溫20 ℃左右，71 h出膜；本實驗溫度控制在26 ℃，從受精卵到卵黃囊仔魚歷時66 h，孵化期間累計積溫為1716 ℃·h，少于俞小先的報道[7]，發育到囊胚期、原腸胚和肌肉效應期相對較長，與同一亞科的似刺鳊鮈相似，初步推斷溫度可以影響花鰭骨的胚胎發育速度[8]。

3.3 花鮚骨胚胎發育時相劃分

花鰭骨胚胎發育特點與大部分鯉科魚類相同，不同地域群體繁殖出的后代發育過程中存在差異，顧若波以購自江蘇太湖的親本為實驗對象，受精50 h后，在眼杯口出現圓形晶體，2 h 30 min后，胚胎開始表現出微弱的肌肉收縮，晶體清晰，發育至肌肉效應期[1]。本實驗親魚來自河南黃河濕地，發育過程中先觀察到肌肉效應期，而后形成晶體出現期。唐魚尾泡消失時進入肌肉效應期[9]，而稀有鮈鯽（Gobiocyprisrarus）尾泡停留時間較長[10]。造成此現象的原因，可能是由于地域環境差異引起的。花鰭骨出膜方式是尾巴先破膜，靠身體擺動，不斷拍擊卵膜，隨后頭部伸出膜外，與似刺鳊鮈[6]和圓斑星鰈（Verasper variegatus）相反[11]。而造成此現象差異的原因有待進一步探討。