外電場操控單分子的偶極取向極化特性研究*

吳瑞祥 張國峰 喬志星 陳瑞云?

1)(山西師范大學物理與信息工程學院,臨汾 041004)

2)(原子分子和材料光譜測量與分析山西省重點實驗室,山西師范大學,臨汾 041004)

3)(山西大學激光光譜研究所,量子光學與光量子器件國家重點實驗室,太原 030006)

4)(山西醫科大學第一臨床醫學院影像科,太原 030001)

1 引 言

單分子光學探測消除了系綜平均效應,已廣泛應用于物理、化學、生物、材料等領域[1-3].單分子的偶極取向[4-6]作為單分子的重要物理參數之一,決定著單分子熒光輻射的偏振特性及空間分布,從而影響單分子的熒光收集效率[7]及基于單分子熒光成像的分辨率[8].生物體系中蛋白質的折疊、肌動蛋白的運動涉及到生物大分子的構象變化,可以通過跟蹤標記的熒光分子的取向變化獲得其動力學過程[9].分子與分子間偶極-偶極相互作用引起的共振能量轉移過程也極大地依賴于兩個單分子相對的偶極取向[10].另外,利用單分子作為載體產生單光子是制備單光子源的有效手段之一[11],基于單光子源的偏振編碼是量子密鑰分發的重要方案[12].單分子的熒光偏振狀態取決于其偶極取向,因此單分子偶極取向的有效操控可為基于單分子的單光子源在量子密鑰分發中的應用提供基礎.人們已經利用寬場散焦成像[13]和掃描共聚焦成像[14]實現了單分子偶極取向的有效測量,但是對單分子偶極取向的確定性操控至今仍然是一個難題.

Huang等[15]在低溫下通過脈沖掃描隧道顯微鏡的金屬尖針,將金屬針尖放置在氯鋁酞菁單分子上方并施加正向偏壓脈沖,將單分子面內朝上的氯原子轉變成面內朝下,改變了單分子的偶極取向,從而實現了單分子二進制位的讀寫操作.Sandoghdar課題組[16]通過選取合適的主客體組合,發現處于對-三聯苯晶體中的terrylene單分子的偶極取向被固定在特定方向,其熒光偏振方向垂直于玻璃基底,隨后獲得了高達96%的單分子熒光收集效率[17].盡管如此,該方法所獲得的分子取向依賴于特定分子與晶體的組合,不便于推廣應用于其他分子.近年來,利用電場實現單分子操控成為人們的研究熱點.Shaik課題組[18,19]用外部定向電場對分子偶極進行選擇從而實現了分子的手性識別;Sajadi等[20]利用強太赫茲電場脈沖耦合到分子偶極矩,共振激發極性液體分子使其重新定向振動;Kato等[21]研究了電場下單分子的超滯后電極化效應.

本文利用外部電場作用于摻雜在聚甲基丙烯酸甲酯薄膜中的極性單分子,在溶劑揮發過程中對極性單分子的偶極取向實現了有效操控.通過測量單分子的熒光偏振方向,研究了外電場對極性單分子偶極取向的極化特性的影響.

2 實 驗

實驗中所用的分子1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′,-tetramethylindodicarbocya-nine (DiD,molecular probes)是極性染料分子,分子結構見圖1(a),圖中紅色箭頭顯示了DiD分子的固有偶極取向.DiD分子的固有偶極矩高達14.9 D (1 D=3.33564×10—30C·m),其極易于被電場操控.DiD分子的吸收峰位于640 nm,熒光發射峰位于660 nm.將DiD分子溶解到氯仿溶劑中,稀釋至～10—9mol/L;10 mg的聚甲基丙烯酸甲酯(poly-(methyl methacrylate),PMMA,分子量15000,Sigma-Aldrich)溶解到1 mL的氯仿和二甲基亞砜溶液(Dimethylsulfoxide,DMSO)混合液(1 ：1混合)中;單分子溶液與溶解有PMMA的氯仿/DMSO溶液混合,制備單分子濃度約為10—10mol/L的混合液;將混合液以300 r/min的轉速旋轉涂覆于玻璃基片上.由于DMSO為難揮發溶劑,旋轉涂覆后單分子樣品溶劑并不會完全揮發.將旋涂有DiD分子的玻璃基片放置于圖1(b)所示的裝置中,分別施加與單分子樣品表面垂直或平行的勻強電場(場強3500 V/mm),測量電場作用下單分子熒光偏振響應特性.電場作用過程在真空(＜ 20 kPa)干燥箱中進行,作用時間設定為90 min,長于溶劑揮發所需要的時間(約60 min).實驗中,選用氯仿和DMSO混合液作為溶劑,減緩溶劑揮發速度,保證在樣品制備過程中電場對單分子的有效操控.溶劑完全揮發后,單分子被固定于PMMA薄膜中.

圖1 (a)DiD分子的結構式,紅色箭頭表示其固有偶極取向;(b)垂直于單分子樣品表面電場和平行于樣品表面電場操控單分子示意圖Fig.1.(a)Structure of DiD dye molecule with its dipole orientation indicated by a red arrow;(b)schematic of single-molecule sample manipulated by applying a perpendicular or parallel electric field to the surface of single-molecule sample,respectively.

外電場操控后的DiD單分子樣品通過共聚焦熒光成像系統[22,23]進行測量.利用波長為635 nm的皮秒脈沖半導體激光器(PicoQuant,PDL808)作為光源激發單分子樣品.激光經過λ/4和λ/2波片調整成為圓偏振光,經過擴束鏡后被二向色鏡(Semrock,Di01-R635-25×36)反射,被油浸顯微鏡物鏡(Nikon,100×,NA=1.3)聚焦到樣品表面,物鏡聚焦光斑的大小約為350 nm.樣品放置在一個三維納米位移平臺(Piezosystemjena,Tritor 200/20 SG)上,通過移動三維納米位移臺實現樣品的掃描和熒光成像.單分子發出的熒光被同一個物鏡收集,經二向色鏡、發射濾波片(Semrock,FF01-642/LP-25-D)及陷波濾波片(Semrock,NF03-633E-25)濾光后,聚焦到直徑為100 μm的針孔進行空間濾波.隨后熒光信號經偏振分束棱鏡(PBS)分成兩束,其中垂直(P)偏振的熒光透過PBS,而水平(S)偏振的熒光被PBS反射,分別進入兩個單光子探測器(PerkinElmer,SPCMAQR-15)進行熒光探測.

3 結果與討論

在共聚焦熒光成像系統上通過逐點掃描的方式對單分子樣品進行熒光成像,實驗中每個像素點的采樣時間是10 ms.圖2(a)顯示了摻雜在PMMA聚合物薄膜中未通過電場作用時DiD分子在18μm×18μm (100像素×100像素)區域里的分布,每個亮點來自不同DiD分子的熒光.由于單分子所處的納米局部環境及單分子偶極取向的差異,使得每個單分子的熒光強度略有不同.為了獲取單分子熒光偏振方向的信息,在得到分子熒光成像后,通過三維納米位移平臺將單個DiD分子移動到激光聚焦區域,測量單個分子在S偏振和P偏振方向上熒光強度隨時間的變化.

單分子的躍遷偶極矩如圖2(b)中箭頭所示,與z軸(激光的傳播方向)的夾角為θ,偶極矩在x-y平面(探測平面)的投影分量與x方向的夾角為α.在二維偏振探測中,α能夠反映單分子熒光的偏振方向,可以通過以下公式[24]計算獲得：

其中,r(t)表示熒光的偏振度,IS和IP分別是單光子探測器測量到的S偏振和P偏振方向上單分子熒光的強度.

圖2 DiD單分子的偶極取向與偏振測量 (a)在18 μm×18 μm區域內DiD單分子的熒光成像;(b)任意偶極取向的DiD單分子的S偏振及P偏振方向熒光探測示意圖,其中Obj是物鏡,PBS是偏振分束棱鏡;(c)成像圖(a)中紅色圓圈標記的DiD分子的S和P偏振方向的熒光強度軌跡圖;(d)熒光偏振方向α隨時間的變化;(e)DiD分子光漂白前熒光偏振方向的統計,最可幾值為48.8°Fig.2.Fluorescence measurement of single DiD molecules：(a)Fluorescence image of single DiD molecules in 18 μm×18 μm area;(b)schematic view of the S-polarized and P-polarized fluorescence of arbitrary dipole moment for single-molecule (Obj,objective;PBS,polarized beam splitter);(c)fluorescence trajectories of single DiD molecule indicated by the red circle in panel (a)in S and P polarization;(d)the relationship between fluorescence polarization and time;(e)the statistics of fluorescence polarization with the most probable value being 48.8°.

圖2(c)顯示的是熒光成像圖中紅色圓圈標記單分子的熒光軌跡,其中單分子熒光在S偏振方向的分量用紅色表示,在P偏振方向的分量用藍色表示.可以發現這個單分子在2.98 s時發生了明顯的熒光閃爍現象,在10.13 s時發生單步熒光漂白,這兩種現象都是單分子所具有的本質特性,表明所觀測的這個分子是單個分子.摻雜在PMMA中的大部分DiD分子輻射的熒光相對比較穩定,呈現較少的熒光閃爍.利用(1)式可獲得單個DiD分子的熒光偏振方向α,其隨時間的變化如圖2(d)所示,可以看出單分子在光漂白之前維持在一個比較穩定的取向.單分子被光漂白后,偏振方向α起伏很大,這是因為信號并不是來源于單分子,而是來自樣品的背景噪聲及單光子探測器的暗計數,與單分子的偶極取向無關.在2.98 s時偏振方向有一個較大的突變也是因為同樣的原因.統計這個DiD單分子的熒光偏振方向分布,得到圖2(e)所示的柱狀圖.利用高斯函數擬合,得到熒光偏振方向α的最可幾值為48.8°,直接反映了這個單分子的躍遷偶極取向.

實驗測量了三種不同情況下DiD單分子的熒光偏振方向α的分布：未加電場、垂直電場作用和平行電場作用,圖3為統計分析結果.對于82個摻雜在PMMA中未通過外電場操控的DiD分子,偏振方向α服從單峰擬合的高斯分布,其最可幾值為41.0°,半高全寬為21.9°,如圖3(a)所示.圖3(b)顯示的是78個摻雜在PMMA中利用3500 V/mm的垂直電場操控后DiD單分子熒光偏振方向α的分布,依然服從單峰擬合的高斯分布,與未加電場時結果相比沒有明顯差別.當3500 V/mm的平行方向的勻強電場對DiD單分子作用后,84個摻雜在PMMA中的DiD分子熒光偏振方向分布如圖3(c)所示.從圖3(c)可以看到偏振方向的分布與前面兩種情況的分布明顯不同.這些DiD單分子熒光偏振方向α的分布呈現兩個峰,用雙峰高斯函數擬合,峰值位置分別對應32.0°和55.5°.研究結果表明,利用平行電場作用于極性DiD單分子,改變了單分子熒光偏振方向的分布,我們認為平行電場作用實現了單分子取向極化,也就是單分子偶極矩傾向于電場方向排列的現象.

當用一個高數值孔徑的物鏡收集單分子熒光時,其熒光偏振度r(t)應該準確地表示成[24]：

式中,θ和α與圖2(a)一致;A,B,C是由高數值孔徑物鏡引入的與角度無關的常數,可能引起所測量偏振方向的并不是均勻隨機分布[25].對未經取向極化的DiD單分子而言,其熒光偏振方向α分布呈現出以41°為中心的高斯分布.

外電場作用于單分子引起其能量的變化[26]可以簡寫為

圖3 DiD單分子在不同情況下取向極化的效果 (a)未加電場;3500 V/mm的(b)垂直電場取向極化和(c)平行電場取向極化;熒光的偏振方向α的統計峰值分別是(a)41.0° ± 21.9°,(b)44.2° ± 26.3°,(c)32.0° ± 13.5°和55.5° ± 21.6°Fig.3.Polarized orientation for single DiD molecules under the different conditions：(a)Non-electric field;(b)perpendicular and (c)parallel electric field of 3500 V/mm.The peaks ofαare (a)41.0° ± 21.9°,(b)44.2° ± 26.3°,(c)32.0° ±13.5° and 55.5°±21.6°,respectively.

其中δ是單分子的偶極取向與外電場方向的夾角.在外電場的作用下,單分子的偶極取向會逐漸偏向于電場的方向(δ→ 0),這就是對單分子產生取向極化的過程.電場強度越大,δ越小,單分子偶極取向極化的偏轉角度Δδ與電場強度有關[27].

電場方向與單分子的偶極取向之間存在三種情況,如圖4所示,其中紅色箭頭是分子的偶極取向.第一種情況如圖4(a)：外電場與分子偶極取向平行(δ=0或180°),電場并不會改變分子的偶極取向.第二種情況如圖4(b)：外電場方向與偶極取向垂直(δ=90°),兩個偶極取向的分子等量地向電場方向偏轉,如圖中藍色箭頭所示,此時分子偶極取向的變化Δδ是一致的.圖4(a)和圖4(b)中極少部分特殊偶極取向的分子并不會引起偏振方向α的雙峰分布.除了上述兩種特殊情況外,絕大部分隨機分布的分子偶極取向與電場方向夾角如圖4(c)：在與電場方向夾角δ較小的單分子被完全取向極化前,兩個分子還是等量地趨向電場方向.由于夾角δ較小的單分子更容易偏轉到電場方向,而夾角δ較大的單分子要想與電場方向一致還需要更強的電場,在這種情況下,兩個分子的偶極取向極化過程不同,存在兩個夾角δ,導致如圖3(c)中平行電場作用下單分子偶極取向的雙峰分布現象.當垂直于x-y平面電場作用于單分子時,電場主要改變的是分子偶極矩的θ角,不會影響單分子偶極取向在x-y平面的投影角度,也就是與光軸垂直平面的單分子的熒光偏振取向α分布,所以垂直于單分子樣品平面電場作用下單分子偶極取向分布基本不變.當平行電場作用于單分子時,引起分子的熒光偏振方向的雙峰分布.這也說明了電場并沒有使得所有的DiD單分子的偶極取向與電場方向完全一致.

圖4 單分子偶極取向在外電場作用下的極化示意圖(a)電場方向與分子偶極取向同向;(b)電場方向垂直于單分子偶極取向;(c)電場作用于任意取向單分子Fig.4.Simplified scheme of the polarization of the dipole orientation of single-molecule under the influence of external electric field.The directions of the electric field are parallel (a),perpendicular (b),and arbitrary (c)to the dipole orientation of single-molecule,respectively.

4 結 論

本文利用外部電場實現了對極性單分子偶極取向的操控,并通過掃描共聚焦熒光成像系統測量了DiD單分子在外電場下的極化特性.摻雜在PMMA聚合物中的DiD單分子的熒光偏振方向服從單峰高斯分布,其最可幾值為41°;當垂直于樣品表面的外電場作用于單分子時,DiD單分子的熒光偏振方向分布沒有明顯變化;當3500 V/mm的外電場平行于樣品表面對分子作用時,摻雜在PMMA中的DiD單分子的熒光偏振方向發生明顯變化,呈現雙峰高斯分布,最可幾值為32°和55.5°,說明通過外電場實現了對DiD單分子偶極取向的極化操控.通過外電場操控單分子偶極取向的方法不需要特定的分子與基質材料的組合,可以適用于大多數極性分子,對于熒光收集效率的提高及能量轉移動力學的研究具有非常重要的意義.