PCR聯(lián)合HPV檢測在宮頸癌篩查中的應用

姚千紅　徐舜　趙倩倩

1資料與方法

1.1一般資料

選取2016年4月～2018年4月我院收治的宮頸癌患者86例，納入標準：（1）經(jīng)醫(yī)院初步檢查確診為宮頸癌且基本生命體征平穩(wěn)者;（2）具有詳細且完善的臨床治療資料者;（3）之前未接受過外科手術(shù)切除治療者。排除標準：（1）患有精神疾病不能配合本研究者;（2）同時并發(fā)其他系統(tǒng)的嚴重疾病者。在回顧性總結(jié)我院對這86例患者的檢查方法的基礎(chǔ)上，依據(jù)是否在接受熒光PCR法進行檢測篩查的基礎(chǔ)上聯(lián)合高危型人乳頭瘤病毒分型核酸測定篩查法，將其分為兩組。對照組患者接受熒光PCR法進行檢測篩查，研究組患者在應用熒光PCR法的基礎(chǔ)上聯(lián)合高危型人乳頭瘤病毒分型核酸測定進行篩查。其中對照組43例，懷孕次數(shù)0～4次，平均（2.39±0.7）次;研究組43例，患者產(chǎn)次0～2次，平均（2.19±0.8）次，年齡20～50歲，平均（21.2±2.4）歲。患者均知情同意本研究，兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

對照組：采用常規(guī)的熒光PCR法進行檢測篩查。第一，對待測基因進行PCR;第二，電泳PCR結(jié)果;第三，分析結(jié)果：若無特定的擴增片斷出現(xiàn)，說明該診斷基因缺失;若擴增片斷的大小與正常基因不同，說明發(fā)生了突變。另外，對PCR擴增片段直接測序，可以診斷未知突變基因核苷酸的改變。使用熒光PCR儀對其GAPDH含量進行檢測，R：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'，F(xiàn)：5'-GAAGGTGAAGGTCGGA-GTC-3'是引物;5'-fam-CAAGCT TCCCGTTCTCAG-CC-tamara-3'是針序列;210 bp是產(chǎn)物。反應中含有模板（5 μL）、6 pmol探針、10 pmol引物、10 pmol Taq酶1.5 U、3.5 mmol MgCl2、200 μmol dNTPs以及10×buffer（2.5 μL），總體積為25 μL。反應條件：在94℃下進行10 min的預變性，94℃下進行30 s的變性，62℃下進行60 s的延伸和退火，共43個循環(huán)。

研究組：在應用熒光PCR法的基礎(chǔ)上聯(lián)合高危型人乳頭瘤病毒分型核酸測定進行篩查，具體檢測步驟：（1）收集患者的宮頸細胞樣本，首先暴露患者的宮頸，在過程中采用引導窺陰器，采用取樣器采集患者的宮頸脫落細胞。（2）樣本篩查：將采集的患者宮頸脫落細胞放入無菌管中，制備帶熒光的人乳頭瘤病毒分型單鏈核酸作為探針，通過PCR法擴增該探針分子，主要包括變性、復性及延伸三步，之后在分子水平上進行樣本的篩查;（3）如樣本檢測呈現(xiàn)陽性或有明顯的癥狀出現(xiàn)，要進行相關(guān)的細胞學檢測;在無菌管中倒入保存液，靜置，除去上清液，進行離心，把樣本烘干染色后進行觀察;（4）進一步行陰道鏡檢查，充分結(jié)合患者的陰道的檢查結(jié)果，如患者病情嚴重則可以采取宮頸活檢檢查，以液基細胞學及病理診斷結(jié)果為金標準進行對比，具體方法囑患者于月經(jīng)過后的3～7 d來院行電子陰道鏡檢查。首先選用被3%醋酸浸泡過的棉球，涂抹宮頸表面約30 s。然后將棉球取出，約2 min后，對宮頸表面行冷光源照射。當宮頸表面由白色變?yōu)榘胪该靼咨⒃僮兊缴园蛋咨⒅敝廖蹪峄野祝∽冞吘壗?jīng)過模糊-銳利-卷曲的變化。血管經(jīng)歷由細小均一的點狀血管變?yōu)殍偳吨梁竦拇姿岚咨掀け砻嫒狈ρ埽詈鬄榇执簏c狀血管。以上述結(jié)果作為評判依據(jù)，進行陰道鏡下子宮頸癌的篩查。

1.3 觀察指標

采用通用的Bethesda 系統(tǒng)（the Bethesda system，TBS）分級系統(tǒng)進行細胞學診斷，結(jié)果為性質(zhì)未定的不典型鱗狀細胞（atypical squamous cells ofundetermined significance，ASCUS）及以上判斷為陽性。對于活檢及LEEP 環(huán)切術(shù)組織，參考WHO（2003）《乳腺及女性生殖器官腫瘤病理學和遺傳學分類》，CINⅠ及以上判斷為陽性。把LEEP 術(shù)后組織病理學診斷作為“金標準”，TCT 篩查結(jié)果和陰道鏡下多點活檢病理診斷與LEEP 病理診斷在同級別之內(nèi)認為符合，不在同一級別判為不符合。對接受檢查的兩組患者進行密切的觀察研究并統(tǒng)計所有患者的高危型人乳頭瘤病毒感染率，并對處在不同年齡段的患者出現(xiàn)的感染情況進行進一步的分析統(tǒng)計，計算感染率，將兩組患者進行比較，分析對不同的宮頸病變發(fā)生高危型人乳頭瘤病毒感染的幾率，感染率=（感染例數(shù)/總例數(shù)）×100%。

1.4統(tǒng)計學方法

應用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件分析處理，計數(shù)資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗，計量資料用（x±s）表示，采用t檢驗，P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同年齡階段高危型人乳頭瘤病毒感染的情況

在接受檢測的86例患者中，有65例患者出現(xiàn)高危型人乳頭瘤病毒感染，總體的感染率75.6%;20～29歲患者的感染率為80.0%，30～39歲患者的感染率為66.7%，40～49 歲患者的感染率為82.1%，50～59歲患者的感染率為73.7%。不同年齡階段高危型人乳頭瘤病毒感染的情況不同（P<0.05）。見表1。

2.2兩組患者高危型人乳頭瘤病毒感染率比較

研究組檢測出的高危型人乳頭瘤病毒感染率高于對照組（P<0.05）。見表2。

3討論

在臨床醫(yī)學中，女性發(fā)生宮頸癌的原因多種多樣，由很多的因素造成，如感染或其日常生活習慣不好、不衛(wèi)生、性生活紊亂或時間較早甚至是過多的進行性生活，均有可能造成患者的宮頸感染，其中HPV感染引起的宮頸癌病變較為常見[3]。在人的身體機能中，宮頸是位于女性子宮下部較為狹窄的部分，呈現(xiàn)圓柱體的形狀，宮頸部陰道處一般分布著鱗狀上皮細胞，在宮頸管的內(nèi)部多呈現(xiàn)上皮細胞，并且宮頸陰道部的鱗狀上皮以及上皮可以在宮頸口進行移動[4]。一旦受到刺激或增加損傷，將增加病毒感染的機率，由于病毒入侵而導致宮頸上皮的不正常增生，即為醫(yī)學上的宮頸癌前發(fā)生病變[5]。在臨床上宮頸癌前病變?nèi)绻患皶r進行干預，則最終將會引起發(fā)展成宮頸癌[6]。所以在臨床上最易引起宮頸癌的就是鱗狀上皮與柱狀上皮進行交接移動的地方[7]。一旦宮頸內(nèi)部的頸鱗狀上皮和柱狀上皮受到病毒損傷，讓病毒成功入侵，則會感染基底層的細胞，發(fā)生上皮細胞的不正常增生，如任其發(fā)展則會導致宮頸癌的發(fā)生[8]。在臨床醫(yī)學上HPV作為一種環(huán)形的病毒，以整合感染及允許感染兩種形式存在患者的身體內(nèi)，大多是在感染后，潛伏在基底的細胞內(nèi)，進行不斷的繁殖增生，一般患者的自身免疫可以清除大部分的入侵病毒[9]。該病毒在患者的身體內(nèi)會潛伏1～2年的時間，如自身免疫系統(tǒng)在2年內(nèi)清除不了感染病毒，則會引起宮頸的感染，在這個過程中不進行干預則最終導致宮頸癌的發(fā)生[10]。臨床上大部分宮頸癌患者均存在HPV 病毒與患者自身基因的整合，一旦HPV病毒與患者自身基因整合將會降低抑癌基因的發(fā)展，由此引起細胞的過度增殖，細胞增殖周期出現(xiàn)紊亂，失去正常的控制，細胞核的不正常分裂，將會導致宮頸癌的發(fā)生[11]。所以說對于女性患者宮頸癌的篩查檢測采用熒光PCR法聯(lián)合高危型人乳頭瘤病毒分型核酸測定具有一定的臨床意義以及時代的價值[12]。

人乳頭瘤病毒（HPV）是一種雙鏈的DNA病毒，這種病毒可以感染皮膚以及體內(nèi)的上皮細胞，將導致患者體內(nèi)產(chǎn)生增殖病變的細胞及乳頭瘤樣改變[13]。人乳頭瘤病毒普遍存在于人類的生活環(huán)境中，具有高度的組織性以及特異性，一旦感染將會引起患者細胞進行不正常的增殖，產(chǎn)生宮頸感染[14]。在現(xiàn)代的醫(yī)學發(fā)展中，分別根據(jù)DNA基因的不同已經(jīng)產(chǎn)生近200種的人乳頭瘤病毒，其中約有1/4的類型可以對人類的生殖道進行感染[15]。人乳頭瘤病毒還可以根據(jù)對人類的感染力度分為低危型以及高危型兩種[16]。在臨床上對人乳頭瘤病毒檢測較為敏感的方法是熒光PCR 技術(shù)進行篩查檢測，但是檢出率相對于熒光PCR法聯(lián)合高危型人乳頭瘤病毒分型核酸測定低，本研究表明，在接受檢測的86例患者中，有65例患者出現(xiàn)高危型人乳頭瘤病毒感染，總體的感染率75.6%;20～29歲患者的感染率為80.0%，30～39歲患者的感染率為66.7%，40～49歲患者的感染率為82.1%，50～59歲患者的感染率為73.7%。不同年齡階段高危型人乳頭瘤病毒感染的情況不同（P<0.05）;研究組檢測出的高危型人乳頭瘤病毒感染率高于對照組（P<0.05）。研究發(fā)現(xiàn)，采用熒光PCR法聯(lián)合高危型人乳頭瘤病毒分型核酸測定對宮頸癌癌前病變的篩查較為準確，在臨床上有較高的參照價值。

綜上所述，熒光PCR法聯(lián)合高危型人乳頭瘤病毒分型核酸測定在宮頸癌癌前病變篩查中有著非常重要的作用以及對于醫(yī)學檢測具有指導作用，檢出率更高，效果理想，臨床上應進一步推廣應用。

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（收稿日期：2018-10-28）